초록 ▼

연구의 목적 및 내용
Voltage-gated 나트리움 이온 통로는 감각신경에서 활동전위를 발생시키고 전달한다. 특히, NaV1.9 이온 통로는 염증을 동반하는 손상 부위에서 통각수용기가 반응하여 일어나는 통증을 조정하는 것으로 알려져 있다.
이 연구의 주된 목적은 재조합 시스템을 이용한 이종 발현을 통해 NaV1.9 이온 통로의 구조와 기능의 연관성을 연구하여 분자생물학적으로 NaV1.9 이온 통로를 in vivo상의 같은 뉴런에서 존재하는 타 나트리움 이온통로 개체의 영향 없는 포유류세포환경에서 분석할 것이다.

연구의 목적 및 내용
Voltage-gated 나트리움 이온 통로는 감각신경에서 활동전위를 발생시키고 전달한다. 특히, NaV1.9 이온 통로는 염증을 동반하는 손상 부위에서 통각수용기가 반응하여 일어나는 통증을 조정하는 것으로 알려져 있다.
이 연구의 주된 목적은 재조합 시스템을 이용한 이종 발현을 통해 NaV1.9 이온 통로의 구조와 기능의 연관성을 연구하여 분자생물학적으로 NaV1.9 이온 통로를 in vivo상의 같은 뉴런에서 존재하는 타 나트리움 이온통로 개체의 영향 없는 포유류세포환경에서 분석할 것이다.
연구결과
1년차 계획 :
●mouse 와 human 의 삼차신경으로부터 1765개의 아미노산으로 이루어진 Na_V.1.9 나트리움 이온 통로의 전체 염기서열(full-length)을 가진 clone을 만든다.
●삼차신경으로부터 Na_V.1.8 이온 통로를 clone한다.
●Na_V.9 나트리움 이온 통로의 보조적 단위인 beta subunit -1, -2, -3, -4등 clone한다.
●Mammalian expression vector인 pCDM8에 재조합된 clone에 GFP나 HA를 붙힌다. Genbank염기서열 data와 비교함으로 Na_V.1.9 이온 통로의 전체 염기서열(full-length)과 일치함 확인한다.
2년차 계획 :
●나트리움 이온 통로의 cDNA clone을 일시적, 지속적인 transfection방법으로 다양한 host mammalian cell-line에 이종발현을 한다
●Na_V.1.9 이온 통로에서의 단백질의 발현과 세포질막에 targeting되는 여부를 confocal imaging, western immunoblot을 통해 분석하고 Na_V.1.9 나트리움 이온 통로의 기능을 patch-clamp 전기생리학적을 분석한다.
●Nav1.9 이온 통로의 보조적 단위인 beta subunit 의 분석과(또는) Nav1.9 이온 통로에서 발현의 단백질 cofactor의 필요 여부를 규명한다.
●전기생리학 워크스테션을 확립하여 나트륨통로 Nav1.9을 전기생리학적 분석을 시행한다.
향후 3년차 계획 :
●Nav1.9 이온 통로의 분자생물학적 기능과(또는) homologous-domain으로 변형된 chimeric Nav1.9/Nav1.8/Nav1.2이온 통로를 patch-clamp 전기생리를 통해 특정화한다.
● Nav1.2 chimeric 나트리움 이온 통로를 사용함으로 Nav1.9 나트리움 이온 통로의 세포내 조절작용을 하는 loops와 양 N-과 C-말단의 구조와 기능분석을 한다.
● 칼슘-활선화 염화이온통로의 말초신경 역할 규명을 위해 기본 기은분석을 침심세포에서 하여 필요한 실험 기볍 및 염이온통로 특이적 분석 쳬계를 마련한다.
연구결과의 활용계획
학문적 파급효과: NaV1.9 이온 통로의 이종 발현의 연구는 통증 신호를 전달하는 분자생물학적 기전의 연구 방법과 다른 나트리움 이온 통로들과 와의 비교를 할 수 있는 새로운 방법을 제시함으로 NaV1.9 나트리움 이온 통로의 구조와 기능을 이해하는데 상당한 공헌을 할 수 있다. 본 연구의 결과로 인해 새로운 가설이 제기될 것이며 다른 연구 활동에 중요한 참고자료가 될 것이다.
산업, 경제적 파급효과: 기본적인 세포 상에서의 이온 통로의 기능을 분석할 수 있는 방법을 제시할 것이며 NaV1.9 이온 통로를 targeting하는 새로운 통증 치료제의 개발에 중축이 될 것이다.
인력양성방안: 박사과정과 석사과정의 기초 과학의 전문 연구자를 육성분야에 활용될 것이다.

Abstract ▼

Purpose& contents
Voltage-gated sodium channels generate and propagate action potentials in sensory neurons. NaV1.9 channel mediates nociceptive pain following inflammatory injury. The main goal of this research is to investigate the structure/function relationships of NaV1.9 channels following s

Purpose& contents
Voltage-gated sodium channels generate and propagate action potentials in sensory neurons. NaV1.9 channel mediates nociceptive pain following inflammatory injury. The main goal of this research is to investigate the structure/function relationships of NaV1.9 channels following stable heterologous expression in recombinant systems. This will permit characterization of the molecular and biophysical properties of this important NaV1.9 channel in pain signaling in isolation from other sodium channel isoforms that are coexpressed in same neurons in vivo.
Result
Characterization of Na_V1.9 channel functional properties in isolation from other contaminating sodium currents has been wanting due to its crucial role in nociceptive pain signaling. To define the functional properties of Na_V1.9 channels, we propose the following set of experiments based on these specific research plans:
Year 1
● Clone full-length mouse and human Na_V1.9 channel encoded by 1765 amino acid residues from trigeminal ganglion (TG).
● Clone full-length mouse Na_V1.8 channel cDNA from TG.
● Clone full-length mouse auxiliary sodium channel subunits beta-1, -2, -3, -4.
● Sequence verify against Genbank data and assemble in mammalian expression vector, pCDM8, directly fused with GFP and/or tagged with HA epitope.
Year 2
● Transient and stable transfection of full-length and chimeric Na_V1.9 channels in various host mammalian cell-lines.
● Na_V1.9 protein expression and plasma membrane targeting analysis by confocal imaging, western immunoblot, and Na_V1.9 channel function by patch-clamp electrophysiological determinations.
● Analysis of auxiliary beta subunit and/or protein cofactor requirement for functional expression of Na_V1.9 channel.
Year 3
● Functional characterization of the biophysical properties of Na_V1.9 channels and/or homologous-domain exchanged chimeric Na_V1.9/Na_V1.8/Na_V1.2 channels by patch-clamp electrophysiology.
● Structure/function analysis of Na_V1.9 intracellular regulatory loops and termini using Nav1.2 chimeric channels.
Expected Contribution
Contribution to Science: Heterologous functional expression of NaV1.9 channels will significantly advance our understanding of NaV1.9 sodium channel biology by providing new tools for investigation of molecular and biophysical mechanisms and comparison of NaV1.9 channel properties with other essential voltage-gated sodium channels in nociceptive pain signalling. The results of our studies will promote generation of new hypothesis testing opportunities and research activities.
Contribution to Industry: It will yield methodological insights into and tools for generation of functional cell-based ion channel assay platform to aid in the development of novel pain pharmacotherapies to target NaV1.9 sodium channel.
Contribution to Student Training: This research proposal is expected to fund the training of at least three graduate students: one PhD-level and two MSc-level.