초록 ▼

연구의 목적 및 내용
1) RNA간섭을 일으키는 RNAi 제제 (shRNA)에 의한 RIG-I 활성화와 RNA간섭 효능사이의 상관관계 확인;
2) 세포 내 RNA 센서인 RIG-I 핵산나선효소에 의한 여러 가지 기질 RNA들에 대한 결합력, 이중가닥 RNA 풀림활성, RNA 의존적 ATP 가수분해활성 등이 세포의 인터페론 발현 유도에 어떤 영향을 주는지 파악
3) Small guide RNA에 의하여 유도되는 RNaseE 의존성 RNA절단 반응에 있어서 가이드 RNA의 분자적 특징 확인
연구결과
가. RI

연구의 목적 및 내용
1) RNA간섭을 일으키는 RNAi 제제 (shRNA)에 의한 RIG-I 활성화와 RNA간섭 효능사이의 상관관계 확인;
2) 세포 내 RNA 센서인 RIG-I 핵산나선효소에 의한 여러 가지 기질 RNA들에 대한 결합력, 이중가닥 RNA 풀림활성, RNA 의존적 ATP 가수분해활성 등이 세포의 인터페론 발현 유도에 어떤 영향을 주는지 파악
3) Small guide RNA에 의하여 유도되는 RNaseE 의존성 RNA절단 반응에 있어서 가이드 RNA의 분자적 특징 확인
연구결과
가. RIG-I 단백질에 상호작용하는 여러 가지 형태의 RNA기질들의 설계 및 RIG-I의 효소학적 활성 조사
1) RIG-I의 발현 및 정제
2) RIG-I와 상호작용이 예상되는 RNA 기질의 설계 및 합성
3) RIG-I와 RNA 기질간이 결합도 측정 및 해리작용 확인
4) RIG-I의 여러 dsRNA 기질들에 의한 ATP 가수분해 촉진 확인 (ATPase assay)
나. RIG-I와 여러 가지 형태의 RNA 기질간의 면역유발 활성의 상호관계 파악
1) 인터페론 reporter 에세이가 가능하며 RIG-I가 과발현 되는 A549 세포주 확립
2) RIG-I가 과발현 되는 A549 세포주에 RIG-I 기질 RNA transfection
3) 인터페론 reporter assay를 통한 기질 shRNA들에 의한 RIG-I 유래 인터페론 활성 측정
4) 인터페론 reporter assay를 통한 여러 dsRNA 기질들에 의한 RIG-I 인터페론 활성 측정 및 RIG-I와 기질간의 상관관계 확인
다. 5'-말단 인산 포함 small guide RNA에 의한 RNase E의 표적 RNA 절단활성화 검증
1) Ribounclease RNase E의 발현 및 정제
2) 다양한 형태의 dsRNA 기질(small RNA-Target RNA)들에 의한 RNase E 의존성 리보핵산 절단 반응 조사
3) small guide RNA의 5'말단 인산에 의한 RNA 절단 반응 촉진 여부 조사
4) small guide RNA가 결합한 RNA의 특정염기서열 부분 인식에 따른 RNase E에 의한 절단염기서열 확인
연구결과의 활용계획
1) 세포 내부면역기전인 RIG-I의존성 선천면역과 RNA간섭현상을 일으키는 Dicer/RISC 단백질 사이의 RNA 기질에 대한 상관관계를 연구함으로써, 세포내로 도입된 RNA의 경로에 대한 기전을 밝혀 기초 학문적 지식 기반을 확충
2) 여러 형태의 RNA 기질들에 대한 RNase E의 small guide RNA에 의한 절단과정의 자세한 메커니즘을 세계 최초로 발표하고자 함.
3) 핵산 기반 약제(Antisense, shRNA, microRNA, siRNA-aptamer conjugate 등) 개발의 핵심 기반 기술력을 제공

Abstract ▼

Purpose&contents
1) Investigation of correlation between RIG-I activation and RNA interference, which is caused by RNAi reagent such as shRNA.
2) Study of how innate immune response (interferon expression) is affected by the cellular RNA sensor, RIG-I enzyme activities, such as binding affinit

Purpose&contents
1) Investigation of correlation between RIG-I activation and RNA interference, which is caused by RNAi reagent such as shRNA.
2) Study of how innate immune response (interferon expression) is affected by the cellular RNA sensor, RIG-I enzyme activities, such as binding affinities on several RNA substrates and RNA-dependent ATPase activity.
3) Characterization of molecular features of small guide RNAs regarding guide RNA-dependent RNA cleavage by RNaseE.
Result
RNA substrates design and investigation of several enzyme activities of RIG-I protein with RA substrates.
1) Expression and purification of RIG-I protein
2) Design and synthesis of RNA substrates for RIG-I protein
3) Measurement of binding and dissociation of RNA substrates
4) Investigation of ATPase activity stimulated by several dsRNA substrates
Investigation of correlation between RNA structures and innate immune response caused by RIG-I
1) Establishment of cell lines expressing RIG-I and applicable for interferon reporter assay.
2) Transfection of RNAs into the A549 cells
3) Measurement of interferon expression caused by RIG-I activation with shRNA
4) Measurement of interferon expression caused by RIG-I activation with other dsRNAs
Investigation of RNA cleavage caused by RNase E and its guide RNA containing 5’-phosphate
1) Expression and purification of RNase E protein
2) Measurement of RNA cleavage with several types of duplex RNAs (guide RNA-target RNA) with RNase E
3) Determination of 5’-end phosphate on the guide RNA for RNA cleavage
4) Investigation of RNA cleavage site on the target RNA
Expected Contribution
● Scientific breakthrough by gaining basic knowledge of innate immunity control. and pharmaceutical application of RNAi based biologics.
● Application of oligonucleotide-based targeted therapy for chronic virus-infected patient.
● Application of RNAi and its immunity activation to design antiviral reagent in which interferon induction can be modulated.
● Global application for biologics pharmaceutical industry by development of effective antiviral oligonucleotides.

목차 Contents

• 핵심연구사업 최종보고서(평가용) ... 1
• 목 차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 9
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 26
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 33
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 34
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 36
• 8. 참고문헌 ... 37
• 9. 연구성과 ... 38
• 10. 기타사항 ... 42
• 끝페이지 ... 55