초록 ▼

정상조직에 비해 암 조직에서 발현이 증가되는 신규 Orphan G-Protein coupled receptor (GPCR) 인 GPR150의 기능분석을 통하여 암 신호전달/조절 기전을 규명하고 생물학적, 임상적 검증을 통한 GPR150 유전자의 암 진단 및 항암 표적으로서의 타당성을 검증하고자 함.
1) Orphan GPCR, GPR150의 발암성 규명 및 임상 검증
○ 위암/대장암/간암 환자 조직에서의 GPR150 유전자 발현 증가 확인
○ 특히 위암 3기 이상의 diffused type에서 유의성이 크게 나타남<

정상조직에 비해 암 조직에서 발현이 증가되는 신규 Orphan G-Protein coupled receptor (GPCR) 인 GPR150의 기능분석을 통하여 암 신호전달/조절 기전을 규명하고 생물학적, 임상적 검증을 통한 GPR150 유전자의 암 진단 및 항암 표적으로서의 타당성을 검증하고자 함.
1) Orphan GPCR, GPR150의 발암성 규명 및 임상 검증
○ 위암/대장암/간암 환자 조직에서의 GPR150 유전자 발현 증가 확인
○ 특히 위암 3기 이상의 diffused type에서 유의성이 크게 나타남
○ 위암./간암/대장암 세포주 30종에서의 GPR150 유전자 발현 증가 확인
○ GPR150 발현 세포주의 세포성장 촉진/Anchorage-independent growth 확인
○ GPR150 발현 세포주의 동물내 이식을 통한 Tumor 형성능 확인
○ GPR150 발현 세포주의 IV injection 및 Orthotopic tumor model 을 통한 Lung 및 Liver, lymph node metastasis, 간비대증 확인
○ siRNA 를 통한 Cancer cell line 의 GPR150에 대한 addiction 확인
○ TG mouse generation 및 형질연구: 각 장기의 종양생성, 백내장, 조기사망
2) Orphan GPCR, GPR150의 암 발생과정에서의 세포성장 촉진 관련 신호전달/조절기전 연구
○ 유전자 과발현과 세포성장 촉진의 상관성 연구
○ Gene Knock-Down 을 통한 암세포 성장 저해관련 세포내 신호전달 연구
○ GPR150 의 세포내 결합 단백질 탐색 (IP와 LC mass 등)
○ 신호전달 저해제 및 신호전달 단백질을 이용한 성장촉진 신호전달 규명
○ Receptor tyrosine kinase (RTK) 와의 Cross-talk 연구
○ 유전자 발현 관련 Transcription Factor 규명
3) Orphan GPCR, GPR150의 전이관련 신호전달/조절기전 연구
○ GPR150 과발현 혹은 Knock-down 에 따른 Metastasis 관련 유전자변화 조사
○ 임상조직과 동물조직을 이용한 전이관련성 타당성 검증
○ 전이 촉진 신호전달과정 규명

Abstract ▼

The purpose of this experiment was to investigate cancer signaling/control mechanisms through the functional analysis of the novel Orphan G-Protein coupled receptor (GPCR), GPR150 gene, is increased in tumor tissue than in normal tissue, and biological, with clinically verified GPR150 is to verify t

The purpose of this experiment was to investigate cancer signaling/control mechanisms through the functional analysis of the novel Orphan G-Protein coupled receptor (GPCR), GPR150 gene, is increased in tumor tissue than in normal tissue, and biological, with clinically verified GPR150 is to verify the validity of the diagnosis of cancer and cancer as the target gene.
G-protein coupled receptors (GPCR) have significant roles in transmitting cell proliferation and/or differentiation signals inside the cells. Abnormal function of GPCRs by mutations oroverexpression has been associated with cancer cell development. A putative GPCR, Gpr150 is a heptahelical cell surface protein that has been described as a novel family of membrane proteins AAAA is cloned by homologous search of BBB that known to be couple with ras1 signaling pathway. Gpr150 transcript is low in most of the normal human epithelial cell except testis. But its transcriptional expression is relatively high in several cancer cell lines and gastric cancer tissues compared to normal tissue. Overexpression of Gpr150 promotes oncogenic transformation of NIH3T3 fibroblast, i.e. facilitated proliferation, loss of contact inhibition, anchorage-independent growth and tumorigenicity in nude mice via activation of Raf1 and Akt signal cascades, particularly stabilization of cyclin D1. Gpr150 is mainly interacted with pertussis toxin sensitive Gαi-2 subunit that inhibited adenylatecyclase and Gpr150-mediated decrease of cAMP level is responsible for induction of insulin-like growth factors (IGFs). Increase of cyclin D1 by Gpr150 overexpression was suppressed by immunoprotection against IGFs, treatment of IGFR inhibitor and in IGFR-/- fibroblast cells. Gpr150-overexpression affects the increase of Sp1 transcription factor via inhibitory Gai signal pathway and increased Sp1 protein induced IGFs and cyclin D1. Therefore, we suggest that Gpr150 is a kind of GPCR that functions through inhibitory Gαi-2 and cross talks with IGFR through IGFs induction, followed by transactivate the RTK signal to stimulate cell proliferation leading to emergence of the cancerous cells.
1) Identification and clinical validation of Orphan GPCR, GPR150 as a oncogene
- Verification of GPR150 gene increase in Gastric/colon/liver cancer tissues
- In particular, GPR150 gene increase appears largely significance in gastric cancer 03 or more and diffused type of gastric cancer.
- Confirmed the Increase of GPR150 gene expression in gastric cancer, liver cancer, colon cancer cell lines
- Facilitated the cell proliferation and promoting anchorage-independent growth by GPR150 expression
- Tumor formation was achieved in animal cell by transplant with stable cells expressing GPR150
- Lung, Liver, and lymph node metastasis, and liver hypertrophy was observed in nude mouse after IV injection of cells expressing GPR150 and orthotopic surgery.
- Verification of addiction for GPR150 in cancer cells by siRNA knock-down experiments
- TG mouse generation
- TG Mouse phenotype studies: tumor generation in various tissue, cataracts, death
2) Studies of signaling pathway and regulatory mechanisms in promoting the carcinogenesis by Orphan GPCR, GPR150 overexpression
- Confirmed the correlation between Gpr150 overexpression and cell proliferation
- Koncked-down of Gpr150 expression using siRNA inhibits the growth of cancer cells
- Identification of interacting proteins with GPR150 protein using IP and LC mass techniques
- Investigation the signaling pathways leading to promote growth by Gpr150 overexpression using signal transduction inhibitors
○ Identification the Cross-talking between Gpr150 and Receptor tyrosine kinase (RTK)
○ Identification of transcription factor in Gpr150 signalling pathway
3) studies mechanisms related to metastasis increased by Orphan GPCR, GPR150 expression
○ Metastasis related genes were changed by GPR150 overexpression or Knock-down
○ Demonstrated that the Gpr150 gene is associated with metastasis using clinical tissue and animal tissue
○ Demonstrated that the signaling pathways of the metastasis promoting by Gpr150 expression

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서(보고서 초록) ... 3
• 요 약 문 ... 4
• SUMMARY ... 13
• CONTENTS ... 16
• 목차 ... 20
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 25
• 1. GPCR 이란? ... 25
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 27
• 제 1 절. 필요성 ... 27
• 1. 암 및 항암제 연구의 필요성 ... 27
• 2. 신규 바이오마커 중요성 ... 29
• 3. GPCR 단백질의 중요성 ... 30
• 제 2 절 국내ㆍ외 현황 ... 31
• 1. 세계 동향 ... 31
• 2. 국내동향 ... 32
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 35
• 제 1 절 실험 방법 ... 35
• 1. RT-PCR ... 35
• 2. Microarray ... 36
• 3. Western Blot 분석법 ... 36
• 4. Immunoneutralization assay ... 36
• 5. Luciferase Reporter assay ... 37
• 6. siRNA 실험 ... 38
• 7. 세포 성장 촉진 ... 39
• 8. 종양 (tumor) 형성능 조사 ... 40
• 9. cAMP assay ... 40
• 10. immunopricipitation assay (IP) ... 40
• 11. Homodimer 형성 확인 ... 42
• 12. Transgenic Mouse 제조를 위한 벡터 제조 ... 43
• 13. CRE luciferase activity ... 44
• 14. GTPrS 결합 실험과 Receptor/ligand 결합 시험을 위한 막 단백질 추출 ... 44
• 15. FlashPlate technology를 이용한 GTPrS 결합 실험과 Receptor/ligand 결합 시험 ... 44
• 제 2 절 결과 및 고찰 ... 45
• 1. Gpr150 유전자 발현 확인 ... 45
• 2. Gpr150 stable 세포주에서의 변화 관찰 ... 48
• 3. 세포신호 전달 기전 연구 ... 51
• 4. Receptor Tyrosine Kinase 와의 상호작용단백질 연구 ... 55
• 5. Endocytosis 관련성 연구 ... 58
• 6. Gpr150 유전자와 직접적으로 결합하는 G-protein subunit 조사 ... 59
• 7. In vivo에서 Gpr150 유전자 연구 ... 62
• 8. 분자모델링을 통한 Gpr150 구조 연구 ... 69
• 9. 약물 검색계 개발 ... 70
• 10. De-Orphanization ... 72
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 75
• 1. 연차별 연구개발의 목표, 내용 및 평가의 착안점 ... 75
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 76
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 78
• 1. 활용방안 ... 78
• 2. 기술적 측면 ... 78
• 3. 경제적ㆍ산업적 측면 ... 79
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 80
• 1. 맞춤치료기술 분야 ... 80
• 제 7 장 참고문헌 ... 83
• 끝페이지 ... 87