초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
< 1세부과제: PCR을 이용한 신규 GM작물의 검정 분석법 개발 >
○ TaqMan real-time PCR을 이용한 GM작물의 삽입유전자 카피수 확인
분자생물학적 분석(Southern blot 등)에 의한 삽입유전자의 카피수 확인의 단점을 보안하기 위하여 PCR을 이용한 형질전환체의 삽입유전자 확인의 프라이머 및 프로브를 제작하였다(TC 및 TC/TMT 형질전환체의 프라이머/.프로브 제작). 이들 제작 프라이머 쌍을 이용하여 Multiplex real-time PCR 반응조건을 구축하고자 하였으

Ⅳ. 연구개발결과
< 1세부과제: PCR을 이용한 신규 GM작물의 검정 분석법 개발 >
○ TaqMan real-time PCR을 이용한 GM작물의 삽입유전자 카피수 확인
분자생물학적 분석(Southern blot 등)에 의한 삽입유전자의 카피수 확인의 단점을 보안하기 위하여 PCR을 이용한 형질전환체의 삽입유전자 확인의 프라이머 및 프로브를 제작하였다(TC 및 TC/TMT 형질전환체의 프라이머/.프로브 제작). 이들 제작 프라이머 쌍을 이용하여 Multiplex real-time PCR 반응조건을 구축하고자 하였으며, 먼저 서로 상이한 형광 염색액을 프로브에 연결하고 동일반응에서 목표유전자에 대한 최적의 프로브를 선발하였다. 이후 Multiplex real-time PCR에 적합한 최적의 각 프라이머 및 프로브를 선정하여 벼 도입유전자 카피수 확인을 위한 Multiplex real-time PCR 시스템의 분석조건을 확립하였다.
○ 라스베라트롤 생합성 GM벼에 대한 검정 분석법 확립
국내 개발된 신규 국내 GM작물에 대한 검정법 확립을 위하여 라스베라트롤 생합성 GM벼의 유전정보를 조사한 후 이벤트에 대한 계통특이, 유전자 특이 및 작물에 대한 검출 마커를 제작/선발하였다. 이후 라스베라톨 생합성 GM벼의 선발계통에 대한 카피수를 재확인하였고, 라스베라트롤 생합성 벼 검출을 위한 최적 프라이머를 선발하였다. 선발된 특이검출 프라이머 쌍에 대하여 각 작물과 이벤트 계통을 이용하여 검출 특이성을 확인하였고, 선발 특이 프라이머 쌍이 효과적으로 특이적 검출이 가능한 것을 확인하였다. 따라서 라스베나트롤 생합성 GM벼에 대한 정성 PCR 검정법을 확립할 수 있었고, 특이 프라이머와 작물에 대한 프라이머를 조합하여 라스베라트롤 생합성 벼 이벤트 계통에 대한 검출한계(Limit of detection, LOD) 측정한 결과 0.1% 수준의 낮은 범위까지 검출이 가능한 것으로 확인되어 상기 프라이머를 GM벼의 환경방출 및 사후 모니터링을 위한 검출 프라이머로 개발하였다. 라스베라트롤 생합성 벼의 정량분석을 위해서는 실시간(real-time) PCR 분석에 대한 프라이머 및 프로브를 개발하였고, 정량 특이 프라이머를 이용한 이벤트 계통 검정을 위한 표준플라스미드를 제작하였다. 이후 표준 플라스미드를 표준물질로 하여 real-time PCR을 수행하고 라스베라트롤 생합성 벼에 대한 정량분석의 보정계수 산출 및 검정조건을 확립하였다.
○ 최신 PCR 기술을 적용한 GMO 검출 시스템 구축 및 효율성 확인
최신 PCR 기술을 이용한 GMO 검출 시스템 구축을 위하여 최근 신속, 효율적인 검출법으로 보고된 LAMP-PCR법을 적용하고자 하였다. 이를 위해서 각 작물 및 목적 유전자에 대한 LAMP 프라이머(1쌍이 4개의 프라이머로 구성) 쌍을 제작하였고, 예비 실험을 통해서 반응성을 확인하였다. 이후 국내외 GMO 검출을 위하여 작물 6종 및 목표유전자에 대하여 7종의 최적 LAMP-PCR 프라이머 쌍을 선발하였다. 선발 LAMP-PCR 프라이머 쌍을 이용하여 각 GMO에 대하여 반응감도 및 검출 반응성을 확인하였다. 또한 신속, 효율적인 GM작물 검출을 위하여 96well 시스템 조건을 구축하고, 실질적인 적용 가능성을 확인하였다.
○ 범용의 표준분자 개발 및 정성 real-time PCR법 도출
Real-time PCR을 이용하여 효율적으로 GMO의 정성 및 정량 검출을 위하여 범용의 표준분자를 개발하고자 하였다. 이를 위해서 먼저 각 작물과 목적유전자에 대한 검출마커 및 검출 프로브를 제작하였고, 예비 분석을 통해서 작물 7종 및 목적 유전자 4종의 프라이머/프로브를 선발하였다. 이들 프라이머를 이용한 PCR을 수행하고 증폭된 각 염기단편을 결합하여 범용의 표준플라스미드(표준물질)를 제작하였다. 제작된 표준플라스미드를 표준물질로 조제한 후 각 작물 및 목적유전자에 대한 real-time PCR을 수행하여 검출 감도를 확인하였다. 상기 결과로부터, 범용 표준분자의 이용으로 정성 real-time PCR 분석이 일반 PCR 분석보다 고감도의 분석이 가능하여 시료 중 낮은 농도의 GMO 분석에 효과적으로 적용할 수 있음을 확인하였다.
< 1협동과제: 최신 나노/앱타머 기술을 이용한 GMO 검정방법 개발 >
○ 제초제저항성(PAT) 단백질 특이 앱타머 제작
앱타머라는 무작위 서열을 가진 방대한 핵산 라이브러리 증폭하였고, GM작물 도입 핵심 유전자 단백질의 담체 고정 및 앱타머 라이브러리와의 반응성을 확인하였다. 또한 각 표적 인자와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 분리 및 회수하고, GM작물 핵심 유전자 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 발굴하였다.
○ PAT 앱타머 이용 검정법 검증 및 이용 가능성 분석
선별 확보된 GM작물 도입 핵심 유전자 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 기능 검증 및 탐지 효율성을 평가하였다.
○ Antibody-PCDA vesicle 및 Antibody-liposome의 제작
Hydration 방법을 이용한 PCDA vesicle 및 liposome 제작하고, EDC/NHS 반응을 통한 antibody-PCDA vesicle과 antibody-liposome 의 제작하였다. 또한 PDA vesicle의 광학적 특성 및 외부 자극에 대한 반응성 연구를 수행하였다.
○ Antibody-PCDA vesicle 및 Antibody-liposome이 융합된 Immunohydrogel Bead™의 제조방법 최적화
본 시스템에 적합한 hydrogel을 선별하였고, 미세유체시스템을 이용해 동일한 물성의 hydrogel bead의 제작이 가능한 자동화 시스템을 개발했다. 항체-PCDA vesicle 및 항체-리포좀 복합체의 광학적 특성에 영향을 주지 않는 hydrogel을 선별하였고, Hydrogel 내부로의 항체-PCDA vesicle 및 항체-리포좀 복합체 포집을 확인하였다. 또한 Immunohydrogel Bead™의 반응성을 확인하여, 목적단백질에 대한 검출능력이 기존의 방법보다 향상된 것을 확인하였다.
○ GMO target을 detection 하기 위한 Immunohydrogel Bead™의 mesh size 및 물성 최적화
Hydrogel 표면의 미세구멍 크기의 확인하고, Hydrogel 표면의 미세구멍 크기의 제어 조건을 구축하였다. 또한 최적의 미세구멍 크기 선정하여, Bead 형태의 hydrogel 제작하였다. Hydrogel bead의 크기 조절 조건을 수립하고, 최적의 Immunohydrogel Bead™ 크기 선정 조건 구축하였다. 이후 GM관련 단백질 확보하여, Immunohydrogel Bead™의 GMO 검출 가능성 확인하였다.
○ Single target Immunohydrogel Bead™의 성능 규명 및 GMO 물질 별 detection을 위한 조건의 최적화
Immunohydrogel Bead™의 single targeting 능력을 검증하고, GMO 시료별 검출조건 최적화 조건 수립하였다. 이후 Immunohydrogel Bead™ 생산을 위한 생산 자동화 시스템을 구축하였다.
< 2협동과제: GM작물의 외래유전자 대량발현 시스템 구축 및 진단법 개발 연구 >
○ 치사 유전자인 Barnase 유전자를 도입하여 재조합 바이러스만 선택적으로 복제되는 개량된 baculovirus expression system을 개발하였다. 또한, transposable element (att)를 이용하여 in vitro transposition에 의하여 목적유전자를 단시간에 바이러스의 게놈 상으로 도입함으로써 high-throughput baculovirus expression system인 bEasyBm system을 구축하였다. bEasyBm DNA를 Bm5 세포에 transfection한 결과, bEasyBac의 게놈 상에서 CpBV promoter의 조절 하에 발현된 Barnase가 곤충 세포에 cytotoxic effect를 보였다. bEasyBm DNA와 donor vector를 30ng:30ng 비율로 in vitro transposition시키고 그 반응산물을 Bm5 세포에 transfection한 결과, 83.3~91.7%의 높은 재조합바이러스 생성율을 보였다. bEasyBm bacmid를 이용하여 생성된 재조합바이러스에는 non-recombinant background가 전혀 존재하지 않았다. bEasyBm을 이용하여 제작된 재조합바이러스 EasyBm-EGFP는 기존의 BmGOZA system을 이용하여 제작된 BmEGFP에 비해 동등하거나 우수한 외래 단백질 발현 효율을 보였다. BmEGFP의 경우 순수부리 과정을 거치지 않을 경우 non-recombinant background가 검출되었으나, EasyBm-EGFP의 경우 순수분리 과정을 거치지 않아도 background가 전혀 존재하지 않았다. Homologous recombination 방식을 통해서 누에 유충에서 재조합 bacmid bEasyBm를 이용하여 순수한 재조합바이러스가 생성됨을 확인하였다. Transfection에 사용한 bacmid와 transfer vector의 양이 증가할수록 재조합바이러스의 생성율은 높아지는 경향을 보였다. bEasyBm bacmid 1 ㎍과 transfer vector 4 ㎍을 co-transfection 하였을 때 100%의 재조합바이러스 생성율을 보였다.
○ 목적 단백질의 N-말단에 partial polyhedrin-EGFP를 융합하여 발현함으로써, 발현된 융합단백질이 형성하는 granular structure를 시각적으로 monitoring 하면서 목적 단백질을 용이하게 정제하는 system을 구축하였다. 외래 단백질로서 Bt Cry1Ac 단백질을 partial polyhedrin-EGFP와의 융합단백질 형태로 발현하는 재조합바이러스 BmPolh19EG-1Ac 및 BmPolh32EG-1Ac는 녹색 형광을 띠는 목적 융합단백질을 강하게 발현하였다. 이러한 융합단백질은 sonication 및 0.01% Tween20 washing 후에도 원심분리로 침전된 pellet에 존재함으로써 과립상태로 발현됨을 확인하였다. Polyhedrin의 19~110번 amino acid 부위를 fusion partner로 사용하였을 때 목적 외래 단백질의 발현 효율이 약 41.5% 높았으며, 목적 외래 단백질의 정제 효율 또한 약 39.2% 높았다. 이러한 결과는 목적 외래 단백질의 최종적인 정제 효율을 고려할 때 polyhedrin의 19∼110번 amino acid에 해당하는 부위를 fusion partner로 사용하는 것이 보다 효율적임을 시사하였다. 유충 령별 및 바이러스 감염일별에 누에 유충에서의 외래 단백질의 발현효율을 조사한 결과, 누에 3령 유충의 경우 바이러스 감염 후 4일째가 3일째에 비해 약간 높은 EGFP 발현효율을 보였다. 그러나, 바이러스 감염 후 3일째에는 누에 유충이 치사하지 않으나 4일째에는 88.2%의 높은 치사율을 보임으로써, 누에 유충의 치사율을 고려할 때, 3령 누에 유충에서의 외래 단백질의 발현 및 수거는 바이러스 감염 후 3일째가 가장 효율적이었다. 과립 상태로 발현된 polyhedrin-EGFP-Cry1Ac 융합단백질로부터 원심분리와 sonication 및 enterokinase 처리를 통하여 목적 단백질인 Cry1Ac를 정제하였다. Polyhedrin-EGFP-Cry1Ac 융합단백질의 과립으로부터 정제된 Cry1Ac 단백질의 살충활성을 배추좀나방을 대상으로 검정한 결과 native Cry1Ac의 살충활성이 거의 그대로 유지됨을 확인하였다. 기능성 단백질 유전자로서 라스베라트롤 생합성 유전자(Rs)를 polyhedrin-EGFP-Rs 융합단백질의 형태로 발현하는 재조합 바이러스 BmPolh19EG-Rs를 제작 하였다. 재조합 바이러스 BmPolh19EG-Rs에 감염된 곤충 세포로부터 polyhedrin-EGFP-Rs 융합단백질의 발현을 확인하였다.

Abstract ▼

More and more genetically modified (GM) crops derived through agricultural biotechnology are cultivated in many countries since they have delivered substantially agronomic, environmental, economic, health and social benefits to farmers and to society at large. Meanwhile, the different social concern

More and more genetically modified (GM) crops derived through agricultural biotechnology are cultivated in many countries since they have delivered substantially agronomic, environmental, economic, health and social benefits to farmers and to society at large. Meanwhile, the different social concerns about the benefits and the potential risks of GM crops are being shown with a different reaction from the public. Thus a continuous management of GM crops is required for the safety utilization of genetically modified organism (GMO). Regulations in the EU, Japan, Korea, etc. require that foods and feeds made of or derived from genetically modified organisms (GMOs) should be approved and labeled according to a threshold. Thus, we performed a research relative to the detection methods of GMO for the environmental and food safety assessment.
First, real-time PCR is a quantitative and extremely precise method with high throughput that could be applied to the analysis of large number of plants by comprising the advantages of being very rapid and requiring little genomic DNA. Here, we demonstrated that the TaqMan real-time quantitative PCR system could be used to examine the transgene copy number and/or homozygotes of transgenic rice with the use of various fluorogenic probes. RBE4, a gene validated to be present as a single copy per haploid Oryza Sativa genome, was used as the endogenous reference to estimate copy number of TMT and TC gene in subsequent generations of transgenic rice plants. Second, transgenic resveratrol synthesis (RS) rice was developed in Korea, which resulted from the transformation events involving resveratrol synthase gene. In this study, specific PCR primer pairs for the detection of GMO was designed on the basis of the flanking junction sequences spanning the plant DNA the integrated gene construct of the RS rice events, and also SPS gene sequence was used as an endogenous reference material. Specificities of all of the designed primers were accessed. Clearly, target specific amplicons could be detected from RS GM rice events. In addition, the limits of detection (LOD) using the event-specific primers of GM rice lines were approximately 0.1% (v/v). Also, we confirmed the quantitative detection method of resveratrol synthesis rice by using the real-time PCR.
Finally, LAMP-PCR in order to apply the latest technology for GMO detection was confirmed the sensitivity of reaction on the samples after making a specific primers. As a result, LAMP-PCR method was possible rapidly and effectively to detect the GMOs. In addition, the rapid qualitative GMO detection method was confirmed using real-time PCR. Using the universial standard metherials could detect a range of crops and target genes with high sensitivity. From the above results, we have been found to be effective to detect GMOs by using a LAMP-PCR method and qualitative real-time PCR method, substantially.
We developed a simple and sensitive colorimetric biosensor in the form of microparticles by using polydiacetylene (PDA) vesicles encapsulated within a hydrogel matrix for the detection of phosphinothricin acetyltransferase (PAT) protein, which is one of the most important marker proteins in genetically modified (GM) crops. Although PDA is commonly used as a sensing material due to its unique colorimetric properties, existing PDA biosensors are ineffective due to their low sensitivity as well as their lack of robustness. To overcome these disadvantages, we devised Immunohydrogel Beads™ made of anti-PAT-conjugated PDA vesicles embedded at high density within a poly(ethylene glycol) diacrylate (PEG-DA) hydrogel matrix. In addition, the construction of Immunohydrogel Beads™ was automated by use of a microfluidic device. In the immunoreaction, the sensitivity of antibody-conjugated PDA vesicles was significantly amplified, as monitored by the unaided eye. The limit of detection for target molecules reached as low as 20 nM, which is sufficiently low enough to detect target materials in GM organisms. Collectively, the results show that Immunohydrogel Beads™ constitute a promising colorimetric sensing platform for onsite testing in a number of fields, such as the food and medical industries, as well as warfare situations.
A novel recombinant bacmid, bEasyBm, that enables the easy and fast generation of pure recombinant baculovirus without any purification step was constructed. In bEasyBm, attR recombination sites were introduced to facilitate the generation of a recombinant viral genome by in vitro transposition. Moreover, the extracellular RNase gene from Bacillus amyloliquefaciens, barnase, was expressed under the control of the Cotesia plutellae bracovirus early promoter to negatively select against the non-recombinant background.
The bEasyBm bacmid could only replicate in host insect cells when the barnase gene was replaced with the gene of interest by in vitro transposition. When bEasyBm was transposed with pDualBac-EGFP, the resulting recombinant virus, EasyBm-EGFP, showed high levels of EGFP expression efficiency compared to that of non-purified recombinant virus BmGOZA-EGFP, which was constructed using the bBmGOZA system. In addition, no non-recombinant backgrounds were detected in unpurified EasyBm-EGFP stocks. Based on these results, a high-throughput system for the generation of multiple recombinant viruses at a time was established. Also, we found that expression by translational fusion of the polyhedrin-enhanced green fluorescence protein (EGFP) led to the formation of granular structures, and that these fluorescent granules were easily precipitated by high-speed centrifugation. Here, we developed an easy, fast, mass purification system using this baculovirus expression system (BES). Cry1Ac foreign protein fused with the partial polyhedrin and EGFP gene at the C-terminus, including an enterokinase (EK) site between EGFP and Cry1Ac protein, was expressed in insect cells. The cells infected by BmPolh19EG-1Ac and BmPolh32EG-1Ac produced fluorescent granules. The Cry1Ac fusion protein was purified from granule-containing cells in three steps: cell harvest, sonication, and EK digestion. Through final enterokinase digestion, Cry1Ac presented mainly in the supernatant, and this supernatant fraction also showed a pure Cry1Ac band. These results suggest that a combined procedure of polyhedrin fusion expression and enterokinase digestion can be used for rapid and easy purification of other proteins.

목차 Contents

• 완결과제 최종보고서 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 11
• 목 차 ... 13
• 제 1 장 서 론 ... 14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 17
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 93
• 제1절 : 목표대비 대외 달성도 ... 93
• 제2절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 96
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 100
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 102
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 104
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 105
• 제 9 장 참고문헌 ... 106
• 끝페이지 ... 110