초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
Cry 단백질은 그람 양성균이며, 포자를 형성하는 세균 종인 Bacillus thuringiensis (Bt)의 살충성 단백질 그룹이다. 전세계에 걸쳐 분리 및 보고 되고 있는 다양한 Cry 단백질들은 오랜 기간 동안 인축과 자연 환경에 가장 안전한 생물학적 방제 인자들 중 하나로 쓰여지고 있다. 또한, 최근에는 Cry 단백질을 encoding하는 유전자를 이용하여 해충에 저항성이 있는 형질전환 작물을 만들기 위해 cry 유전자를 작물에 도입하고 있다.
본 연구에서는 형질전환 작물에 적합하며 보다 향상된

Ⅳ. 연구개발결과
Cry 단백질은 그람 양성균이며, 포자를 형성하는 세균 종인 Bacillus thuringiensis (Bt)의 살충성 단백질 그룹이다. 전세계에 걸쳐 분리 및 보고 되고 있는 다양한 Cry 단백질들은 오랜 기간 동안 인축과 자연 환경에 가장 안전한 생물학적 방제 인자들 중 하나로 쓰여지고 있다. 또한, 최근에는 Cry 단백질을 encoding하는 유전자를 이용하여 해충에 저항성이 있는 형질전환 작물을 만들기 위해 cry 유전자를 작물에 도입하고 있다.
본 연구에서는 형질전환 작물에 적합하며 보다 향상된 살충성을 갖는 cry-1 type 유전자를 제작하기 위하여 기존에 이미 식물형질 전환용으로 제작되어 있는 modified cry1Ac 유전자를 template으로 하여 multi site-directed mutagenesis를 수행하였다. Active domain을 encoding 하는 1857 bp 의 modified cry1Ac를 Mutagenesis하기 위해 식물 선호 codon usage을 바탕으로 제작된 16개의 mutagenic primers를 가지고 PCR을 수행하였다. 그 결과, domain I 에서 8개의 residue, domain II 에서 16개의 residues에 위치하는 총 24개 아미노산이 여러 조합으로 치환된 모두 34 종류의 다양한 mutant cry genes을 확보하였다.
Mutant Cry 단백질의 특성을 알아보기 위하여 34개 mutant cry genes을 baculovirus expression system을 이용하여 발현하여 정상적인 크기의 단백질이 생성됨을 확인하였으며, trypsin으로 activation된 mutant 단백질들은 SDS-PAGE 상에서 모두 65 kDa의 안정한 형태를 보여 주었다. 발현된 단백질들은 배추좀나방, 옥수수조명나방 및 파밤나방을 대상으로 하여 생물검정을 수행하였다. 3령 배추좀나방 유충에 대한 생물검정 결과, Mut-N04, Mut-N06 및 Mut-N16의 LD₅₀값이 대조구 단백질인 Mod-Cry1Ac 보다 5-6배 낮았다. 갓 부화한 옥수수조명나방에 대한 생물검정에서는 Mut-N04, Mut-N06 및 Mut-N16 의 LD₅₀값이 Mod-Cry1Ac 보다 약 2-4배 낮았다. 한편, 2령 파밤나방을 대상으로 한 생물검정에서 Mod-Cry1Ac은 살충성을 보이지 않았으나, Mut-N04, Mut-N06 및 Mut-N16의 LD₅₀값은 Cry1C에 비해서는 비슷하거나 낮은 살충성을 보였다.
이상의 결과를 통해 배추좀나방, 파밤나방 및 옥수수조명나방과 같은 나비목 해충에 대해 높은 살충성을 가지는 Mut-N16과 같은 mutant cry genes을 선발하였고, 이 후에 선발된 유전자를 형질전환 작물에 도입함으로써 보다 효과적인 살충성 형질전환 작물 개발에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼

Bacillus thuringiensis (Bt) is a gram-positive, sporulating bacterium that produces a variety of proteins, in the form of large crystalline (Cry) inclusions, which demonstrate toxicity to a variety of insect and nematode pests. Varieties of Cry proteins have been found around the world, which has be

Bacillus thuringiensis (Bt) is a gram-positive, sporulating bacterium that produces a variety of proteins, in the form of large crystalline (Cry) inclusions, which demonstrate toxicity to a variety of insect and nematode pests. Varieties of Cry proteins have been found around the world, which has been widely used as one of the most successful biological control agent. That is regarded as environmentally friendly, with little or no effect on humans, wildlife, pollinators, and most other beneficial insects and are used in Organic farming. Thus, cry genes encoding these Cry proteins have been widely applied for construction of transgenic crops resistant to pest insects.
In this study, to construct of novel Bacillus thuringiensis cry1-type genes for genetically modified crops and to select the most appropriate cry gene for transgenic crop with enhanced insecticidal activity as template. For effective expression in a plant, cry1Ac gene was modified to plant-preferring codon usage by multi site-directed mutagenesis. Through mutagenesis study for the Mod-Cry1Ac, 8 and 16 amino acid residues from domain I and II, respectively, responsible for its insecticidal activity against larvae of Plutella xylostella , Spodoptera exigua and Ostrinia furnacalis were identified. For this mutagenesis, 1857 bp of modified cry1Ac (Mod-cry1Ac) encoding active domain was used as a template and amplified by polymerase chain reaction with 16 mutagenic primers based on cry1Ac sequences. Consequentially, 34 different kinds of mutant cry1Ac genes with improved the insecticidal activity randomly changed 24 amino acid sequences into Cry1Ac were obtained.
For further characterization, these mutant cry genes were expressed as a fusion protein with polyhedrin using baculovirus expression system. These mutant cry genes encode potent insecticidal proteins in the form of crystalline protoxins of 95 kDa. SDS-PAGE analysis of the recombinant polyhedra revealed that expressed Cry proteins was occluded into polyhedra and activated stably to 65 kDa by trypsin. When the insecticidal activities of these mutant Cry proteins against to larvae of P. xylostella, S. exigua and O. furnacalis were assayed, they showed higher or similar insecticidal activity compared to those of Cry1Ac and Cry1C. In the bioassay of third-instar larvae of P. xylostella, LD₅₀ values of these mutant Cry protein was lower about 5-fold than Mod-cry1A, the control Bt protein. In the bioassay of second-instar larvae of S. exigua, Mod-Cry1Ac showed no insecticidal activity, on the other hand not as effective as Cry1C but 8 Mut-Cry1Ac showed insecticidal activity. Also, LD₅₀ values of mutant Cry protein through quantitative bioassay was lower about 2-fold than Mod-cry1Ac against O. furnacalis. Through quantitative bioassay, several mutant cry genes showing higher insecticidal activity, such as Mut-N04, Mut-N06 and Mut-N16 to P. xylostella and O. furnacalis, might be expected as desirable cry genes for the introduction to genetically modified crops.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• 목차 ... 7
• 제 1 장 서 론 ... 8
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 8
• 제 2 절 국내·외 연구현황 비교 및 필요 연구 분야 ... 9
• 제 3 절 연구개발 목표 및 내용 ... 11
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• 제 1 절 국내 연구 현황 ... 14
• 제 2 절 국외 연구 현황 ... 15
• 제 3 절 연구결과가 국·내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 16
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 17
• 제 1 절 재료 및 방법 ... 17
• 제 2 절 결과 및 고찰 ... 19
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 59
• 제 1 절 목표대비 대외달성도 ... 59
• 제 2 절 정량적 성과 ... 59
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 63
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 64
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 66
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 67
• 제 9 장 참고문헌 ... 68
• 끝페이지 ... 69