초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
유용 유전자 BrTSR53의 기능 연구는 배추 식물체에서 염분, 저온, 건조 스트레스에 저항성을 가지는 것으로 microarray 분석방법으로 확인된 신규유전자 BrTSR53 (Triple Stress Resistance 53 gene)을 Quantitative real time-PCR (qRT-PCR) 분석방법으로 재확인하였다.
식물발현 binary vector인 35S-bar vector를 이용하여 이벤트 제작을 위한 유용 유전자의 벡터를 제작하였다. abiotic stress (저온, 건조, 염분)

Ⅳ. 연구개발결과
유용 유전자 BrTSR53의 기능 연구는 배추 식물체에서 염분, 저온, 건조 스트레스에 저항성을 가지는 것으로 microarray 분석방법으로 확인된 신규유전자 BrTSR53 (Triple Stress Resistance 53 gene)을 Quantitative real time-PCR (qRT-PCR) 분석방법으로 재확인하였다.
식물발현 binary vector인 35S-bar vector를 이용하여 이벤트 제작을 위한 유용 유전자의 벡터를 제작하였다. abiotic stress (저온, 건조, 염분)에 내성을 가지는 것으로 예상되는 배추 유전자 BRAS0001S00022015 (BrTSR15, Triple Stress Resistance 15)와 BRAS0001S00024153 (BrTSR53, Triple Stress Resistance 53)를 선별하여 35S-bar vector에 cloning 하여 35S:BrTSR15와 35S:BrTSR53 vector로 재구성하였다. 또한 미생물 유래 내동성 유전자로 기능이 밝혀진 UtrCSP를 cloning하여 35S:UtrCSP 벡터와 생산성 증대 및 내재해성을 가진 버섯유전자 Glyceroladehyde-3-Phosphate Dehydrogenase(GPD)를 cloning하여 35S:GPD 벡터로 재구성 하였다. 이들 벡터는 과다·전신발현 벡터로서 agrobactrium을 이용한 벼의 형질전환방법을 이용하여 GM벼 제작을 진행 중에 있다.
벼의 형질전환방법 및 형질전환체 제작과 분석은 Agrobactrium을 이용한 벼의 형질전환 방법을 사용하였으며, 벼의 형질전환은 동진벼를 사용하였고 형질전환 방법은 시간의 단축과 체세포변이를 줄이기 위하여 early infection 방법을 수행하였다. 종자를 파종하여 5일후에 agrobactrium을 접종하고 선발배지에 옮겨서 저항성 캘러스를 선발하여 재분화하였다.
벼 형질전환체 분석은 재분화 T0 식물체의 genomic DNA 추출하여 Bar gene을 이용하여 PCR방법으로 형질전환체 유무를 확인하였다. TaqMan copy number assay 방법을 이용하여 삽입된 T-DNA 수를 결정하였으며 1 copy 삽입 식물체만 선별하여 flanking T-DNA sequencing 방법으로 삽입 위치를 확인하였다. 1 copy 삽입/intergenic 형질전환체만 선별하여 T2 세대에서 homozygosity 계통을 선발하였다. homo/hetero 계통 선발은 TaqMan copy number assay 방법으로 이용하여 1 copy 삽입은 hetero 계통으로, 2 copy 삽입은 homo 계통으로 확인하였다.
GM작물 대량 육성시스템 구축 및 실용화 지원 결과로 품종보호출원을 하였고 (출원번호:20130-290, 2013-741), 농업형질의 고정화를 통한 이벤트 계통의 조기 육성에서 인공교배 조합이 드리미2호’/Ds변이체(유색미) 외 33조합을 수행하여 2389립의 교배립 수확하였다. 잡종집단 육성은 P31/삼강’조합(고지방) F₃ 집단과 드리미 2호/흑미2Ds’ (항산화 활성)의 2개 집단을 육성하였다. 약배양에 의한 유용형질 조기 고정은 F₁ Drimi 2^*3/AR1 조합으로 수행을 하였으며, 식물체재분화 효율 향상은 배지조성 및 배양방법에 따른 One-step culture와 Two-step culture의 배양효율 비교하여 그 효율을 구축하엿다. 분자마커 개발은 지방함량과 관련된 분자마커 개발과 QTL mapping, 품종 식별 EST-SSR 개발 및 활용, 알칼리 붕괴도 관련 마커를 개발하여 MAS 육종체계를 확립하였다.
국내특허 보유 유전자의 중국내 품종에의 도입을 통한 GM 벼 공동 개발을 위하여 국내특허 보유 후보유전자인 Bt유전자 계열을 분양하여 중국내 품종에 도입을 통한 GM벼 공동 개발을 수행하였다. 형질전환용 중국 품종은 p1(秀水123), p6（秀水134), p8(沪稻55)을 사용하였고 Agrobacterium을 이용한 벼의 형질전환은 시간 단축과 체세포변이를 줄이기 위하여 early infection 방법을 사용하였으며 종자를 파종하여 5일후에 agrobacterium에 접종하고 선발배지에 옮겨서 저항성 캘러스를 선발하여 재분화 하였다.
조직배양을 이용하여 만들어진 T0 형질전환계통 포장 전개하였고 형질전환계통의 TaqMan Real-Time PCR을 통한 copy수 확인하였다.
선발된 3계통중 8계통의 고정계통을 T2세대로 진전시켜 포장 실험을 수행하였으며 T2세대에서 genomic DNA PCR을 이용하여 계통 당 10개의 고정된 개체를 선발하였다.
인디카 계열 웅성불임 계통 육성을 위하여 2014년 F1 종자를 상해농과원 포장에서 전개하였고 PCR 결과 모두 Bt 유전자를 갖고 있다. 이들 종자는 지속적인 여교잡을 통해 모품종과 동일한 웅성불임계통과 회복친으로 발전시킬 계획이다.
이벤트 세대 촉진 등 GM 벼 육성을 위한 전진 기지를 활용하였는데, 국내개발 형질 전환체의 해남도 육종전진기지 활용 동계 세대촉진을 위한 조기 이벤트화 추진했다. 동계 세대촉진 계통은 제1협동과제에서 농업형질을 검증한 계통 및 사업단에서 주문하는 우수 계통 중심으로 선택하여 주요 농업형질을 검정하고 고정을 추진한다.
중국과의 정보교환을 통한 효율적인 GM 벼 개발을 위하여 중국 현지에서 필요로 하는 농업 특성 강화 GM벼 개발하고, 공동연구의 결과로 수집하는 유전자원 활용 육종재료 확보하였다.

Abstract ▼

We have generated 383 independent transgenic lines for genetically modified (GM) rice that contained GPD, UtrCSP, BrTSR15 and BrTSR53 genes overexpression constructs under the control of the constitutive CaMV 35S promoter. TaqMan copy number assay was determined inserted T-DNA copy number. Also FSTs

We have generated 383 independent transgenic lines for genetically modified (GM) rice that contained GPD, UtrCSP, BrTSR15 and BrTSR53 genes overexpression constructs under the control of the constitutive CaMV 35S promoter. TaqMan copy number assay was determined inserted T-DNA copy number. Also FSTs analysis was isolated from 203 single copy T-DNA lines of transgenic plants and sequence mapped to the rice chromosomes. In analyzing single copy lines, we identified 95 FSTs, among which 37 (38.9%) were integrated into genic regions and 58 (61.1%) into intergenic regions. About 27 homozygous lines were obtained through multi-generations of planting, resistance screening and TaqMan copy number assay. To investigate the transgene expression patterns, quantitative real-time PCR analysis was performed using total RNAs from leaf tissue of single copy, intergenic region of T-DNA insertion and homozygous T2 plants. The mRNA expression levels of the examined transgenic rice were significantly increased in all of the transgenic plants. In addition, myc-tagged 35S::BrTSR15 and 35S::BrTSR53 transgenic plants were displayed higher levels of transgene protein than WT plants. These results may be useful for producing of large-scale transgenic plants or T-DNA inserted mutants in rice.
Variety protection was applied (Application No. 20130-290, 2013-741) from the establishment of large scale development system in GM crops and commercialization supporting. Also 2389 hybrid seeds from 33 combinations in artificial crossing including Drimi 2/Ds mutant lines (colored rice) were harvested in rapid development of event lines through the fixation of agricultural traits. In the hybrid population development, two population from P31/Samgang’ (high fat) F₃ and‘Drimi2/Heukmi2Ds’(Antioxidantactivity)was developed. Rapid fixation of useful traits by anther culture was conducted through F₁Drimi2^*3/AR1 and the efficiency were established for efficiency improvement of plant regeneration compared with culture efficiency of‘One-step culture’and‘Two-step culture’according to components of medium and culture method. For development of molecular markers, the breeding system by marker-assisted selection (MAS) was established from the development of molecular markers associated with lipid content and alkali digestion value, QTL mapping, and EST-SSR markers for identification of cultivars.
In the present study，the transgenic rice “Xiushui 134” with cry1Ac1 was developed by Agrobacterium mediated transformation method. Confirmed by PCR, all the 12 independent transformants were cry1Ac1- positive plants.Using semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR), the cry1Ac1 gene expression could be detected in all independent transformants. Using real time quantitative PCR (qPCR) analysis, we found that 3 out of 12 transformants harbored a single copy cry1Ac1 gene. In order to study the integration site，the flanking sequences of these three transformants were amplified by thermal asymmetric interlaced (TAIL)-PCR. The result showed that the T-DNA of one of them inserted into genes interspace on the rice chromosome 2, about 2.4 kb upstream from the Os02G0539500 (Ch.2： 20858661~20860159) gene, and did not disturb other rice functional genes. This transformant was used as primary material to self-cross and segregate, and finally we got the homozygous cry1Ac1 lines. The resistance to leaf folder and agronomic traits of the lines were tested in field at natural conditions. The results showed that the homozygous cry1Ac1 rice plants had strong resistance to leaf folder while main agronomic traits were almost unaffected. These results indicate that we have successfully developed homozygous cry1Ac1 lines with highly resistant to leaf folder but main agronomic traits almost the same as controls.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• 목차 ... 9
• 제1장 서 론 ... 10
• 제1절 세계 GM작물재배 및 연구 현황 ... 10
• 제2절 GM작물의 기여와 현실화 필요성 ... 10
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 12
• 제1절 국내 연구 현황 ... 12
• 제2절 국외 연구 현황 ... 13
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 16
• <제1세부과제 : 유용유전자 도입 벼 형질전환체 대량 육성> ... 16
• <제1협동과제 : 농업형질 기능검정 일괄 순환시스템 구축 및 지원> ... 30
• <제2협동과제 : 중국 지역적응 GM벼 개발> ... 56
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 61
• 제1절 목표대비 달성도 ... 61
• 제2절 정량적 성과 ... 62
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 63
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 63
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 64
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 64
• 제9장 참고문헌 ... 65
• 끝페이지 ... 68