초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 당대사 개선용 형질전환 벼 육성
가. 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 major ampullate 실크 단백질 유전자가 도입된 과발현 형질전환 벼 제작 및 특성
본 연구에서 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 실크 단백질을 코딩하는 major ampullate 실크 유전자의 부분 염기서열을 클로닝을 하여 종자 특이 발현 promoter인 GluC pomoter와 유전자를 연결하고 항생제 저항성 유전자 Bar 부위가 있는 pPZP-3'PINII-Bar vect

Ⅳ. 연구개발결과
1. 당대사 개선용 형질전환 벼 육성
가. 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 major ampullate 실크 단백질 유전자가 도입된 과발현 형질전환 벼 제작 및 특성
본 연구에서 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 실크 단백질을 코딩하는 major ampullate 실크 유전자의 부분 염기서열을 클로닝을 하여 종자 특이 발현 promoter인 GluC pomoter와 유전자를 연결하고 항생제 저항성 유전자 Bar 부위가 있는 pPZP-3'PINII-Bar vector에 삽입하여 construct를 제작하였다. 제작한 vector construct를 벼에 형질전환 시키기 위해 아그로박테리아(EHA105)를 이용하여 벼 callus에 접종하여 형질전화 벼를 제작하였다. Southern blot 분석과 Taq-Man real time PCR 분석을 이용하여 1 copy 형질전환 벼를 선발 하였고, Northern blot 분석을 이용하여 출수 후 시간별 유전자 발현 양상을 확인하였고, 유전자 발현이 강한 계통을 선발하였다. Western blot 분석을 통한 종자 내 major ampullate silk protein 발현을 검정하였고, 목적 단백질의 과발현으로 인한 glycine, serine, alanine 과 glutamic acids의 특정 아미노산 함량이 증가하였다. 이러한 아미노산의 증가는 산왕거미 실크 단백질이 당대사 개선효과에 대해 기능성 물질로 잠재력을 나타낸다. 형질전환 벼는 야생형 벼에 비해 초장이 비교적 작았고 수량이 증대하는 농업적 특성을 보였다.
2. 당대사 개선용 유전자 발현 분석 및 동물 검정
가. 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 major ampullate 실크 단백질의 부분 염기서열 클로닝 및 특성
거미 실크는 다양한 특성으로 인하여 생기능성 물질로서 큰 잠재력을 가지고 있다. 본 연구에서 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 실크 단백질을 코딩하는 major ampullate 실크 유전자의 부분 염기서열을 클로닝과 특성에 대하여 밝히고자 한다. 산왕거미로부터 major ampullate silk protein 유전자(AvMaSp)의 부분 cDNA를 클로닝하였다. AvMaSp의 C-말단은 240개의 아미노산으로 구성된 반복적인 영역과 99개의 아미노산으로 구성된 비반복적인 영역으로 구성되어 있다. 거미 유래 major ampullate silk protein에서 나타나는 아미노산 (A)n, (GA)n 및 (GGX)n이 AvMaSp의 반복적인 영역에 잘 보존되어 있다. 또한, 계통도 분석에서 AvMaSp는 거미 major ampullate spidroin과 그룹을 형성하며 같은 family에 속하였다. 반복적인 영역인 240개의 아미노산을 코드하는 AvMaSp-R을 재조합 베큘로바이러스를 감염시킨 곤충세포주에서 22 kDa의 단백질로 발현되었다. 재조합 단백질 AvMaSp-R은 trypsin에 의해 아주 빨리 분해되었으나, 100 ℃의 높은 온도에서 적어도 30분 동안 안정적이었다. 또한, 재조합 단백질 AvMaSp-R은 pH 2∼12에서도 1시간 동안 안정적이었다. 이러한 결과들은 산왕거미 유래 major ampullate silk 단백질의 분자적 구조 및 생화학적 특성을 나타내며, 거미 실크 단백질의 생기능성 물질로서 잠재력을 나타낸다.
나. 거미 실크 피브로인의 당뇨쥐오부터 인슐린 분비 증가 효과와 혈중 당대사 개선 효과
누에 고치와 거미 줄을 만드는데 사용되는 피브로인 실크 단백질은 아미노산 글라이신과 알라닌이 풍부하다. 최근 연구에서 누에의 실크 피브로인의 가수분해시킨 성분은 혈중 당대사와 지질대사 개선 효과를 나타내었다. 따라서, 본 연구에서 제2형 당뇨쥐에서 거미 실크 단백질을 이용한 항당뇨 효과를 연구하였다. 산왕거미의 major ampullate silk protein에서 240개의 아미노산으로 구성된 반복적인 영역인 AvMaSp-R을 베큘로바이러스를 이용한 곤충세포에서 재조합 단백질을 생산하였다. 당뇨쥐에 재조합 단백질 AvMaSp-R을 구강 투여하여 혈중 인슐린과 혈당을 분석한 결과, 인슐린 분비량은 증가되었고 혈당은 대조구에 비하여 낮은 것으로 나타났다. 결과적으로, 거미 실크 피브로인 단백질은 제2형 당뇨쥐에서 인슐린 분비를 촉진시킴으로써 혈당을 저하시킨다는 것을 처음으로 밝혔다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results of the Research and Suggestion for the Application
1. Characterization of the transgenic rice expressing spider fibroin protein
The AvMaSp gene was inserted into the pPZP-3'PINII-Bar vector under the GluC promoter in the sense orientation. The construct was introduced into Agrobacte

Ⅳ. Results of the Research and Suggestion for the Application
1. Characterization of the transgenic rice expressing spider fibroin protein
The AvMaSp gene was inserted into the pPZP-3'PINII-Bar vector under the GluC promoter in the sense orientation. The construct was introduced into Agrobacterium tumefaciences (EHA105) by electrophoration. A. tumefaciences-mediated rice transformation was performed using the general rice transformation protocol (Toki, 1997; Cho, et al.,1998; Amitabh, et al., 1999). Transgenic T1 plants were selected on MS medium containing carbenicillin (200 mg/L) and PPT (3 mg/L) and then transferred to soil and allowed to self-pollinate. For screening of the transgenic rice containing AvMaSp cDNA gene, PCR was performed with gene-specific primers. Southern blot analysis of genomic DNA suggested the presence of AvMaSp gene as a single copy. The expression of the AvMaSp of the transgenic rice at different stages of development was confirmed by northern and western blot analyses. A strong expression was observed at 40 days. Immunofluorescence staining demonstrated that AvMaSp was only expressed in the embryo. These results show that AvMaSp is particular expressed and accumulated in the rice embryo. Milled rice grain sample were subjected to free amino acid analysis. The level of some of the other amino acids significantly increased in plants overexpressing AvMaSp gene. These include glycine, serine, alanine and glutamic acids. Three different transgenic lines were planted for phenotype investigation by observing and comparing differences between wild-type (WT) and transgenic plants. Transgenic lines were shorter than the WT line and displayed fewer grains compared to the WT. Some agronomic characters in the transgenic rice were changed by the Agrobacterium-mediated transformation.
2. Molecular cloning and characterization of the partial major ampullate silk protein gene from the spider Araneus ventricosus
Spider silks have great potential as biomaterials with extraordinary properties. Here, we report the cloning and characterization of the major ampullate silk protein gene from the spider Araneus ventricosus. A cDNA encoding the partial major ampullate silk protein (AvMaSp) was cloned from A. ventricosus. An analysis of the cDNA sequence shows that AvMaSp consists of a 240 amino acid repetitive region and a 99 amino acid C-terminal non-repetitive domain. The peptide motifs that were found in the spider major ampullate silk proteins, (A)n, (GA)n, and (GGX)n, were conserved in the repetitive region of AvMaSp. Phylogenetic analysis further confirmed that AvMaSp belongs to the spider major ampullate spidroin family of proteins. The AvMaSp-R cDNA, which encodes the 240 amino acid repetitive domain, were expressed as a soluble 22 kDa polypeptide in baculovirus-infected insect cells. Recombinant AvMaSp-R was degraded abruptly by trypsin. However, AvMaSp-R was stable at 100 ℃ for at least 30 min. Additionally, the AvMaSp-R was stable at pH values from 2 to 12 for at least 1 h. Taken together, our findings describe the molecular structure and biochemical properties of the A. ventricosus major ampullate silk protein and demonstrate its potential as a biomaterial.
3. Spider silk fibroin enhances insulin secretion and reduces blood glucose levels in diabetic mice
Fibroin silk proteins make up the cocoons of silkworms and spider webs and are rich in glycine and alanine residues. Recent studies have shown that silk fibroin hydrolysate from silkworms improves blood glucose and lipid metabolism. In the present study, we investigated the anti-diabetic effects of spider silk fibroin protein in type 2 diabetic mice. Recombinant AvMaSp-R, which consists of the 240 amino acid repetitive domain of major ampullate silk protein (AvMaSp) from the spider Araneus ventricosus, was produced in baculovirus-infected insect cells. We tested the effects of oral AvMaSp-R administration on serum insulin and blood glucose levels diabetic mice. Consequently, our results are the first to provide evidence that silk fibroin protein from spiders enhances insulin secretion, which leads to reduced blood glucose levels in type 2 diabetic mice.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• 목차 ... 12
• 제 1 장 서 론 ... 13
• 1. 연구개발대상 기술의 경제적․산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 13
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 15
• 1. 국내 연구 현황 ... 15
• 2. 국외 연구 현황 ... 15
• 3. 국내외 연구현황 비교 및 필요 연구 분야 ... 17
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 18
• 1. 제1 세부 연구내용 및 방법 ... 18
• 2. 제1세부 결과 및 고찰 ... 22
• 3. 제2세부 연구내용 및 방법 ... 51
• 4. 제2세부 결과 및 고찰 ... 56
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 68
• 제1절 목표대비 대외달성도 ... 68
• 제2절 정량적 성과 ... 69
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 70
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 71
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 72
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 73
• 제 9 장 참고문헌 ... 74
• 끝페이지 ... 77