보고서 정보
주관연구기관 |
충남대학교 Chungnam National University |
연구책임자 |
이긍주
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참여연구자 |
전영주
,
김성기
,
마기윤
,
장리리
,
김인경
,
이가연
,
문은성
,
정성진
,
최영인
,
그외 다수
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-02 |
과제시작연도 |
2014 |
주관부처 |
농촌진흥청 |
사업 관리 기관 |
농촌진흥청 Rural Development Administration |
등록번호 |
TRKO201500010209 |
과제고유번호 |
1395035871 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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초록
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Ⅳ. 연구개발결과
NGS를 통해 확보한 2배체 참억새 잎 및 지하경 EST 서열 정보를 de novo assembling을 통해 잎에서 총길이 140Mb의 12166개, 지하경에서 총길이 155Mb의 13170개 contigs를 확보하였다. Unigene set를 Phytozome 및 NCBI non redundant protein database와 BLAST를 이용하여 비교한 결과, 기존 transcripts들과 약 99.8%가 매치됐고, 식물 종별로는 특히 수수(Sorghum bicolor)와 상동성이 높게 나타났다. 발현
Ⅳ. 연구개발결과
NGS를 통해 확보한 2배체 참억새 잎 및 지하경 EST 서열 정보를 de novo assembling을 통해 잎에서 총길이 140Mb의 12166개, 지하경에서 총길이 155Mb의 13170개 contigs를 확보하였다. Unigene set를 Phytozome 및 NCBI non redundant protein database와 BLAST를 이용하여 비교한 결과, 기존 transcripts들과 약 99.8%가 매치됐고, 식물 종별로는 특히 수수(Sorghum bicolor)와 상동성이 높게 나타났다. 발현된 단백질들은 Gene Ontology association에서 각각의 기능을 확인하였다. 기능이 확인된 EST는 GO annotation에 따라 biological, cellular 및 molecular 기능별로 분류하였다.
또한 참억새의 잎과 지하경에서 공통으로 발현하는 contig 수와 특이적으로 발현하는 contig 수 비교하기 위해 contig그룹을 query와 subject로 놓고 blast를 수행하여 출현 빈도 및 억새 2조직(잎, 지하경) EST library에서 고빈도로 발현되는 contig를 대상으로 비교 검토하였다. 그 결과, 억새 잎에서는 C4 pathway 광합성회로에 특징적으로 나타나는 PEPC3, 중탄산을 분해하여 이산화탄소와 물로 분해하는 carbon anhydrase와 같은 탄소대사와 관련된 유전자가 많이 나타났으며, 지하경에서는 phenylalanine ammonia-lyase와 malic enzyme과 같은 질소대사에 관련된 단백질과 여러 대사 과정에서 생성된 gulcose와 fructose로부터 sucrose를 생성sucrose synthase 1 이 많이 나타났다.
4배체 물억새는 참억새와 동일한 방법으로 시퀀싱을 하였다. 그러나 물억새의 경우 분석의 효율성을 위하여 조직을 통합하여 재어셈블리 후 19,685개의 contig (평균 1,020bp, 전체 20Mb)를 확보하였다. UniProt nr protein database와 BLASTX를 수행한 결과 전체 contigs의 약 65%가 매치되었고, 각 카테고리별로 15~50% 정도 annotation 되었다. 또한 물억새의 잎과 지하경에서 공통으로 발현하는 contig 수와 특이적으로 발현하는 contig 수 비교하기 위해 contig그룹을 query와 subject로 놓고 blast를 수행하여 출현빈도 및 억새 2조직(잎, 지하경) EST library에서 고빈도로 발현되는 contig를 대상으로 비교하였다.
참억새와 물억새 4개의 라이브리로부터 유래한 EST에서 microsatellite를 확인한 결과 참억새의 잎에서는 948개, 지하경에서는 776개가 발견되었으며, 물억새의 잎에서는 549개, 지하경에서는 609개가 발견되었다. 각각의 평균길이는 17.6, 17.6, 18.0, 17.5 nucleotide이며, Mbp당 Count는 각각 80.3, 63.8, 63.3, 77.8로 나왔다. SSR motif의 분포를 확인한 결과 2종 억새 모두 tri-nucleotide가 각각 76%, 79%, 73%, 80%로 가장 많이 분포하였고, 다음으로 tetra-nucleotide가 각각 14%, 12%, 11%, 13%로 많이 분포 되어 있었으며 각각의 mono-(0-1%)와 penta-nucleotide (1-2%)에서 가장 적게 분포되어 있었다. 참억새와 물억새에서 가장 많이 분포하는 tri-nucleotide의 반복타입을 확인한 결과, 모두 CCG가 가장 많이 분포되어 있었고, 그다음으로 AGC가 차지하고 있었다. SSR motif가 가장 많이 분포하는 tri-nucleotide는 ORF부분에 많이 위치해 있는 것을 볼 수 있고, 2번째로 많이 분포하는 tetra-nucleotide는 ORF부분보다 UTR지역에 많이 위치하고 있음을 알 수 있었다.
참억새 잎 조직 유래 EST로부터 프라이머 길이(18-27bp), Tm (50℃ ~ 60℃, 적정 온도는 55℃), GC content (최소 20-40% ~ 최대 60-80%), 그리고 증폭 amplicon의 크기(100-300bp) 조건을 설정하여 현재 271 SSR primer set을 확보하여, SSR 명명과 Forward/reverse primer pair 정보를 농업생명정보센터(NABIC)에 등록하였고 PCR 증폭을 보유한 억새를 대상으로 확인하였다. Multiplex PCR 조건 확립을 위해 orthogonal test를 통하여 annealing temp., cycle 수, 예상 allele size를 확정하여 2~3개의 SSR 마커로 구성된 multiplex set을 확보하였다.
참억새와 물억새간의 SNP 탐색 결과 오류검증을 완료한 후 억새를 reference으로 하여 참억새를 비교 분석을 수행한 결과 HomoType SNP는 10,729개, HeteroType SNP는 19,240개가 발견되었고, 참억새를 reference으로 하여 물억새를 비교 분석을 수행한 결과 HomoType SNP는 10,773개, HeteroTypeSNP는 13,759개가 발견되었고, Molecular marker 형성을 위한 Primer 디자인시 HRM(High Resolution Melting)을 적용할 수 있도록 Primer Set을 제작(Primer3)하였고 Product size는 80~150bp가 되도록 조정하여 참억새의 잎에서 261개, 지하경에서 225개 등 총 486개의 SNP primer set를 제작 완료하였다.
확보된 참억새 및 물억새 EST DB로부터 Biomass 관련 유전자를 분류하고, KEGG 분석을 한 결과 식물의 길이생장에 관여하는 GID1(GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1) 및 DELLA 유전자를 찾아냈다. GID1은 5‘-UTR, ORF(2개의 Exon과 1개의 intron으로 이루어짐), 3’-UTR 구조로 되어 있으며 ORF부분에서 GID1 critical motif도 찾아냈다. 보유하고 있는 GID1과 다른 작물에서의 GID1을 amino acid alignment 한 결과, Hormone-sensitive lipase(HSL) domain과 HSL active site가 존재하였으며, GA binding site부위도 존재하는 것을 확인하였다. DELLA는 GA1 유전자에서 DELLA domain과 TVHYNP부위를 찾아냄. 찾은 서열을 가지고 protein 구조를 알아본 바, 3‘-UTR, ORF, 5’-UTR로 이루어져 있고, START codon과 STOP codon까지 존재하고 있었다.
Transcription Factor(TF) 및 Transposable Element(TE) 분석을 하여 유전자 상위 조절인자의 탐색의 기능을 검증함. 참억새 잎의 경우는 bZIP (12.7%) 유전자가 가장 많고, 지하경에서는 ERF (9.7%)가 많이 존재하였고, 물억새는 잎에서 WRKY (10.1%) 유전자가 가장 많고, 지하경의 경우, ERF (11.5%)가 많이 분포하고 있음을 알 수 있었다. 억새의 조직별로는 CPP와 VOZ 유전자는 지하경에서만 관찰 되었으며, NF-X1은 반대로 잎에서만 관찰되었고, 억새의 종류별로 보면 E2F/DP는 참억새의 지하경에서, YABBY는 참억새의 잎에서만 관찰되는 것을 알 수 있었다. TE의 경우, 물억새 지하경을 제외한 모든 조직에서 Ty3/gypsy가 관찰되고, Ty1/copia type의 retrotransposon은 모든 억새에서 관찰되지 않았고. CACTA transposon은 참억새와 물억새의 잎에서만 관찰되었고, HAT는 참억새에서만 관찰되었다.
보유하고 있는 수집 및 변이체 억새 유전자원을 대상으로 제작한 SSR 및 SNP 마커의 효용성을 확인하기 위해 allele 분포를 확인하기 위해 서울대, 농진청 바이오에너지작물센터와 공동연구를 통해 본 연구진이 개발한 EST-SSR마커를 분양하여 각 기관의 억새 유전자원에 이용하도록 하였고, 본 실험실에서는 바이오에너지작물센터에서 197종류의 참억새 잎을 샘플링하여 개발한 EST-SSR마커를 활용하여 유전자원의 유전다양성 분석을 실시하고 각각의 locus별로 allele range 평가를 통해 핵심집단 구축을 위한 기초연구를 실시하였다.
억새 수집종 중에서 Cosmopolitanx참억새(CNU05A09) (population 1)과 Cosmopolitan x 참억새(CNU05A06) (population 2)를 각각 모본과 부본으로 하여 교배한 후 종자를 얻어 이들을 대상으로 개발된 SSR marker를 시험 적용하였으나 개체 확보가 적어 현재 공동연구를 실시중인 미국 연구실의 교배 집단 일부를 분양받아 (2배체 M. sacchariflorus x 2배체 M. sinensis ) F1 집단을 확보하였다.
유전자 특이 CAPS 또는 SCAR 마커의 개발을 위한 기초로 본 연구실에서 보유하고 있는 다분지성 변이체와 야생형을 대상으로 CAPS 마커 개발을 하였고. 현재 억새의 ITS(internal transcribed spacer)-CAPS 마커 가능성을 알아보기 위한 염기서열, ITS 구조, 프라이머 제작 및 증폭조건이 확립되었다.
억새 어셈블된 contig들을 Burrows-Wheeler Aligner(bwasw function을 기준) 수수 제놈 시퀀스와 정렬시켜 최소 2개 이상의 억새 contig가 수수 exon에 맵핑이 되는 것을 골라냈다(=paralogous sequences). 골라낸 억새 paralogous exon을 대상으로 NCBI dbEST에서 사탕수수 EST와 정렬시키고, 마찬가지로 옥수수 등에도 적용해 본 결과 Ks value는 PAML에서 보여진 Yang-Nielsen 기법을 이용하여 계산한 결과 억새와 사탕수수간에 더 많은 유전자가 서로 공유하고 있음을 보여주었다. 본 연구결과 진화적으로 볼 때 수수로부터 억새와 사탕수수가 함께 제놈 복제와 함께 분리된 후 최근에 사탕수수가 억새로부터 한 번 더 분화된 사실을 알 수 있었다. 따라서 본 진화연구를 통해 억새와 사탕수수의 경우 훨씬 많은 유전적 동질성이 있을 수 있고, 상대적으로 억새의 경우가 사탕수수보다 수수와 유사한 기능의 유전자가 많이 있을 것으로 기대된다.
Abstract
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Concerns on global warming in combination with the increased use of fossil fuel have spurred growing interest in sources of renewable energy. The stable and continuous flow of future biofuels will require a constant supply of biomass grown specifically for biofuel production. A tall perennial rhizom
Concerns on global warming in combination with the increased use of fossil fuel have spurred growing interest in sources of renewable energy. The stable and continuous flow of future biofuels will require a constant supply of biomass grown specifically for biofuel production. A tall perennial rhizomatous Miscanthus belongs to the family Poaceae. Miscanthus is one of the widely used plant feedstocks for biomass production in the world. Despite the increasing values of the plant, limited sequence information exists to facilitate basic cultivation, plant development, genomics and breeding studies. Therefore, this project is to develop and apply EST-based molecular markers for improving cultivars of Miscanthus and to explore useful genes related to Miscanthus biomass production from the EST collection and other grass species through comparative study.
Assembly of leaf and rhizome EST of two Miscanthus species generated a total of 12,166 and 13,170 contigs from the leaf (MSIL) and rhizome (MSIR) cDNA libraries of M. sinensis, respectively, and 8,731 and 8,104 contigs from the leaf (MSAL) and rhizome (MSAR) libraries in M. sacchariflorus, respectively. More than 39.1% of transcripts were specific to M. sinensis or M. sacchariflorus libraries. The leaf libraries of the two Miscanthus species had 5,314 highly similar contigs which was 43.7% in MSIL and 60.9% in MSAL whereas the rhizome libraries had the 4,461 contigs whose proportion in MSIR and MSAR were 33.9% and 55.0%, respectively. Based on the exploration of SSR motifs, the number of SSR motifs was 1,724 in M.sinensis (leaf: 948, rhizome: 776) and 1,158 in M. sacchariflorus (leaf: 549, rhizome: 609). The most common repeat motifs were tri-nucleotide whereas penta-nucleotide was lowest. Among the detected motif, major type was CCG and AGC of tri-nucleotide repeat and the majority of the motifs were located in the ORF regions than untranslated regions (UTRs). Especially, the tri-nucleotides were almost localized in the ORF region, but di- and tetra-nucleotides were more frequent in UTR regions.
After going through QC and trimming processes, the obtained contig numbers from 4 libraries (diploid leaf and rhizome, and tetraploid leaf and rhizome) were 12166, 13170, 8732, and 8104, respectively. Because some of the contigs are expected to be redundant, about 21K and 14K contigs from diploid and tetraploid Miscanthuses, respectively, were used to identify SNP loci, resulting in 10,729 and 10,773 homo-type loci. We designed 486 SNP candidates fitting to HRM analysis where the melting temperature and expected allele size enabled to set PCR conditions and allele verification.
The developed and confirmed Miscanthus SSR and SNP markers were distributed to other researchers in Korea, who is studying genetic diversity among Miscanthus collections. Also the markers in my lab were applied to develop the mapping population for QTLs which are associated with biomass production and flowering features.
Some candidate genes related to flowering time in Miscanthus were selected from the Miscanthus EST sequence database. A flowering locus T (FT) gene which induces flowering transition under short day condition was detected only in the Miscanthus leaf, which showed 98% identity with the gene from Sorghum bicolor. A gene GI (GIGANTEA) activating the expression of other flowering genes responding to the photoperiod was identified both in the leaf and rhizome tissues, which showed 94%, 96% identity with the gene from Zea mays, respectively. A kinase-dependent regulatory protein, 14-3-3 was detected in Miscanthus leaf and rhizome with 97 and 98% identity, respectively. An acidic protein, CKA2α (casein kinase 2 alpha subunit) was also identified both in the leaf and rhizome tissues, which showed 98%, 99% identity with the gene from sorghum, respectively. Two stem elongatio-related genes, GID1 (GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1) and Della were studies.
Transcription factor analysis using the Miscanthus transcriptiomes showed that bZip was the most abundant (13%), followed by WRKY (11%), NAC (8%) in MSI leaf tissue, but ERF (10%), WRKY(8%), and MYB (7%) were the majors in MSI rhizome tissue. Comparatively Myb-related TF was detected the most (11%) in MSA leaf tissue, followed by WRKY (10%) and ERF (8%), while ERF (12%), Myb-related (9%) and WRKY (8%) were the majors in MSA rhizome tissue. CPP and VOZ were detected only in the rhizome, while transcription factor NF-X1 was leaf-specific. Similarly E2F/DF was appeared only in MSI rhizome, but YABBY was the only TF in MSI leaf tissue. Interestingly those TF were found to be involved specifically at different phases of development.
Similarity search showed that 383 out of 768 rhizome-enriched genes found in the two Sorghum species (S. halepense and S. propinquum) have at least one ortholog in Miscanthus ESTs, and 171 have orthologs in both leaf and rhizome from the two Miscanthus species. Thirty one rhizome-enriched genes were all expressed in both leaf and rhizome in two Miscanthus species, but rhizome ESTs of M. sacchariflorus are still closer to rhizome-enriched genes from the two sorghum species, which could be caused by regulatory changes in the upstream regions of those genes. Genes showing rhizome-enriched expression in rhizomatous Sorghum species appear to correspond more closely to those in M. sacchariflorus which has aggressive rhizomes, than those in M. sinensis that has weak rhizomes. Allopolyploidy in a common Miscanthus-Saccharum ancestor ~3.8-4.6 mya is closely associated with divergence from the Sorghum lineage. Following Miscanthus-Saccharum divergence about 3.1 mya, Saccharum-specific autopolyploidy may have created pseudo-paralogous chromosome groups with random pairing within a group but infrequent pairing between groups.
The developed EST-SSR and EST-SNP markers in Miscanthus in Korea will be applied to explore allelic variations in the Miscanthus collections, to identify individuals with superior traits of interest, to tag QTL and genes in the genome, and to select progenies with target traits in marker-assisted cultivar development. Also, the obtained Miscanthus EST DB will be valuable genetic resource which will be widely used to explore candidate genes and comparative study with other grass species.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 10
- 목차 ... 13
- 제 1 장 서 론 ... 14
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 19
- 1 절. 국내 연구 현황 ... 19
- 2 절. 국외 연구 현황 ... 21
- 3 절. 국내외 연구현황 비교 및 필요 연구 분야 ... 23
- 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 27
- 1 절. 연구개발 수행내용 및 범위 ... 27
- 2 절. 연구 결과 ... 31
- 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 85
- 1절 : 목표대비 대외 달성도 ... 85
- 2절 : 정량적 성과 ... 87
- 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 96
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 97
- 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 98
- 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 98
- 제 9 장 참고문헌 ... 99
- 별첨 1 증폭 확인된 SSR primers ... 101
- 별첨 2 참억새 및 물억새 SNP 후보군의 Primer set ... 108
- 끝페이지 ... 122
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