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Kafe 바로가기주관연구기관 | (주)농우바이오 NongWooBio Co., Ltd |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2014-02 |
과제시작연도 | 2014 |
주관부처 | 농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 | TRKO201500010225 |
과제고유번호 | 1395035912 |
사업명 | 차세대바이오그린21 |
DB 구축일자 | 2015-07-11 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201500010225 |
Ⅳ. 연구개발결과
1절. 1년차 연구개발결과
1. 3개의 바이러스 유전자(CMVP1-CP; CVMV-HC-Pro; TSWV-CP )를 이용한 RNAi 벡터를 제작
2. 이 벡터를 이용하여 각 바이러스 유전자별 T0 를 개발
3. 2010년 만들어진 PepMoV-HC-Pro-C 형질전환체에 대한 세대 진전 및 접종 선발
4. ChiVMV 또는 TSWV가 식물에 감염되었을 때 siRNA을 유도시켜 silencing을 시킬 수 있는 binary vector (pK7GWIWG2 (II)::Chi N-term, M
Ⅳ. 연구개발결과
1절. 1년차 연구개발결과
1. 3개의 바이러스 유전자(CMVP1-CP; CVMV-HC-Pro; TSWV-CP )를 이용한 RNAi 벡터를 제작
2. 이 벡터를 이용하여 각 바이러스 유전자별 T0 를 개발
3. 2010년 만들어진 PepMoV-HC-Pro-C 형질전환체에 대한 세대 진전 및 접종 선발
4. ChiVMV 또는 TSWV가 식물에 감염되었을 때 siRNA을 유도시켜 silencing을 시킬 수 있는 binary vector (pK7GWIWG2 (II)::Chi N-term, Middle 그리고 C-term 클론들과 pK7GWIWG2 (II)::TSWV N-term, Middle 그리고 C-term 클론)를 개발
5. 고추 유래의 프로모토, 터미네이터를 선발하여 고추 형질전환용 벡터를 제작
6. tflA 유전자를 selection 마커로 삽입한 vector의 형질전환을 위해서 toxoflavin을 합성
2절. 2년차 연구개발 결과
1. GM고추의 바이러스 검정 및 선발(2011년 부터 확보한 GM고추)
- PepMoV-HC-Pro-C 저항성 형질전환체 3 개 Origin 개발(54-6, 10-2, P33; ATIS 성과물로등재)
2. PepMoV-HC-Pro-C GM고추 육성 및 여교배 실시(2009년 부터 확보한 기존 GM고추)
- PepMoV-HC-Pro-C GM고추 T20에 대해 4개의 국외계통과 여교배
3. bar gene을 이용한 새로운 벡터 개발 및 이를 이용한 고추 형질전환체 개발(2012년 부터 착수)
- 바이러스의 유전자를 이용하여 형질전환용 PZPANDA vector (PZP 200 변형, gateway RNAi)를 제작, 고추 형질전환 진행
4. PepMoV-HC-Pro-C GM고추의 copy 수 분석(2011년 부터 확보한 GM고추)
- PepMoV-HC-Pro-C GM고추의 copy 수 분석결과 2 copy 2 Origin과 1 copy 1 Origin(#10-2)으로 확인되었음
5. 고추 바이러스 저항성 바이러스유래 유전자 탐색 및 선발
- CMV의 RNA1 유전자의 일부를 이용한 RNAi vector 개발 및 효과검정
- TSWV의 NSs 유전자 부위를 이용한 RNAi vector 개발 및 형질전환식물체 개발
6. 고추 바이러스 저항성 조기선발 및 검정기술 개발
- GFP가 발현되는 식물바이러스의 leaf disc들로 바이러스 저항성 조기선발기술을 개발
- E.coli에서 생성되는 dsRNA vector를 개발과 효과검정
7. 고추 유래 프로모터와 결합된 벡터 제작
- 총 5종류의 벡터 cassette 제작
8. 프로모터와 결합된 GFP의 발현 확인을 통해서 발현양이 높은 프로모터 선발
- 고추를 이용한 Agro-infiltration 가능성 확인
- CaMV35S 프로모터에 비해 효율이 높은 고추 유래 프로모터 선정(총 5종류)
9. 고추 프로모터를 이용한 RNAi 벡터 제작
- 두 종의 고추 프로모터를 이용한 RNAi 벡터를 제작하여 향후 고추용 RNAi 벡터 제작에 이용
3절. 3년차 연구개발 결과
1. 바이러스 유전자를 이용한 고추 형질전환체 개발을 위해 Bar gene 이용한 RNAi 벡터로 기존 CIT (callus-induced transformation) 방법으로 형질전환 수행하였음. Bar gene 이용한 RNAi 벡터로 고추형질전환 할 때의 최적의 조건을 찾고, 최대의 효율을 올릴수 있는 방법을 얻고자 GFP를 삽입하여 형질전환하였으나 형질전환체를 얻지못함
2. GM 고추의 바이러스 검정 및 선발을 통해 event로 확인된 10-2 T4세대 확보함
3. 계통 선발을 위해 T20의 T3 선발주를 국외계통에 backcross하였으며, BC4F1세대까지 종자를 확보함.
4. GM라인 10-2와 T20, non-GM라인 C15와 THK에 대해 원예적 형질을 조사하였음. 각 10주씩 2 반복으로하여 조사한 결과, 유의성이 없음을 확인함.
5. 바이러스 유전자를 형질전환하여 선발된 개체의 event 확인을 위해 분자생물학적 연구를 수행하였다. 고추 형질전환체 7개의 origin에 대하여 copy number를 알고자 Southern 분석하였고, #10-2 한 개체가 1 copy임을 확인하였음. 10-2에 대하여 도입유전자의 삽입부분 및 부위전체의 염기서열 분석결과 event임을 확인함.
6. 바이러스저항성 GM고추는 대상바이러스인 PepMoV-Vb1에 저항성을 가짐.
7. 바이러스저항성 GM고추는 비대상바이러스인 CMV에 감수성을 가짐.
8. 바이러스저항성 GM고추의 siRNA을 유도시키는 도입유전자가 안정하게 발현되고 있음을 확인함.
9. 바이러스저항성 GM고추와 non-GM고추의 염색체의 크기와 수는 동일함.
10. Beta-tubulin, histon4, Rubisco 등 3종의 고추프로모터로부터 각 3종씩 크기를 줄인 프로모터를 만들어 GFP 유전자를 발현시키는 벡터 9종을 제작을 완료하였음.
11. Beta-tubulin, Rubisco 프로모터를 이용한 RNAi 기본벡터 2종을 제작하였고 이를 이용하여 5종의 담배유전자를 이용하여 고추프로모터 발현 RNAi 벡터 10종을 제작하였음.
12. 고추프로모터의 RNAi 벡터상에서 발현여부를 검증하기 위해 엽록체 생합성 유전자인 NbChlG 유전자 RNAi 벡터를 제작하여 담배에 도입하였다. T0 의 표현형 관찰을 통해 형질전환체의 잎의 색이 wildtype 식물체의 잎에 비해 엷은 녹색인 것을 관찰하였고 RT-PCR 분석을 통해 NbChlG RNAi 벡터의 NbChlG 유전자에 대한 발현저해를 확인하였음. 일련의 T0 식물체 분석을 통해 고추프로모터의 발현에 의해 RNAi 벡터가 발현됨을 확인하였음.
4절. 4년차 연구개발 결과
1. 각 바이러스에 저항성 GM고추 event 구축하고 각 event 당 서로 다른 유전자부위에 삽입된 독립개체 3개 확보하여 위해성평가용 총 9점의 GM고추 개발을 하고자 한 최종 연구목표에 따라 PepMoV-HC-Pro-C GM고추 N2011, T20, #10-2 총 3개의독립개체를 개발
2. 바이러스 유전자를 이용한 고추 형질전환체 개발 (bar선발)
- 형질전환체 개발을 위해 pTF101.1-bar-gfp vector와 pMCG1005 vector를 새로 제작
3. 이벤트로 확인된 형질전환체의 원예학적 특성 연구
- 이벤트로 확정된 #10-2와 T20에 대하여 원예학적 특성을 연구
- GM고추와 non-GM고추간의 원예적형질의 차이가 없음을 확인
4. PepMoV-HC-Pro-C GM고추 계통육성을 위한 여교배실시 (N2011, T20)
- 계통선발을 위해 T20, N2011을 국외라인과 여교배하여 BC5F1까지 확보
5. GM고추의 유전자이동 조사
- 유전자이동 조사를 수행하여 GM고추의 안전성을 확인; probe은 PepMoV-HC-Pro-C 를 사용하였음
6. 고추 바이러스 저항성 바이러스유래 유전자 탐색 및 선발
- 고추의 생장과 과육에 문제를 일으키는 ChiVMV, TSWV, CMV 바이러스에 저항성을 유도 할 수 있는 RNA silencing 운반체 개발
7. 고추 바이러스 저항성 조기선발 및 검정기술 개발
- TSWV 393-C transgenic Nicotiana benthamiana와 bacterially expressed TSWV dsRNA vector 제작 및 효율성 검정과 고추바이러스 저항성 조기선발 및 검정을 위한 GFP발현되는 leaf disc제작
8. 고추 바이러스 병리연구 및 저항성 기능 해석
- GM고추의 목표된 바이러스와 목표 이외의 다른 바이러스를 대상으로 siRNA 발현 검정 및 GM고추와 non-GM고추의 핵형분석
9. 바이러스저항성 GM 고추의 분자생물 특성 분석 등 위해성평가 기본연구
- GM고추에 도입된 운반체의 삽입 유전자 35S promoter, HC-Pro, NPTII, 35S terminator 확인 및 Copy수 검정과 대상 바이러스인 PepMoV와 비대상 바이러스인 PepMoV, PMMoV, CMV-Ca-P1 바이러스에 대한 저항성 검정
10. 고추프로모터 발현벡터 제작
- 신규 2종의 고추프로모터의 선발 및 벡터 카세트 제작 완료
11. 고추프로모터 발현 RNAi 벡터 도입 형질전환체 개발
- 고추프로모터 을 통해 발현 가능한 RNAi 벡터 도입 형질전환체 개발
- Oxidase 유전자 RNAi 벡터 도입 담배 형질전환 완료
- NbChlG 유전자 RNAi 벡터를 이용하여 고추프로모터 RNAi 벡터의 발현여부 검정
12. 고추프로모터 발현 RNAi 벡터 형질전환체 후대분석
- T1 식물체 생육 및 표현형 관찰 완료. β-tubulin 프로모터::GFP 도입 형질전환체 T2 종자확보
In Korea, CMV (cucumber mosaic virus) is the most frequently occurring virus with a single infection rate of 45%. However, a total occurrence of CMV by co-infection, either couple or multiple, with BBWV (broad bean wilt virus), PepMoV (pepper mottle virus) and PMMoV (pepper mild mottle virus) covers
In Korea, CMV (cucumber mosaic virus) is the most frequently occurring virus with a single infection rate of 45%. However, a total occurrence of CMV by co-infection, either couple or multiple, with BBWV (broad bean wilt virus), PepMoV (pepper mottle virus) and PMMoV (pepper mild mottle virus) covers over 90% in the field cultivation of pepper. The PepMoV is transmitted by several aphid species, and it has been considered the most frequently detected potyvirus when it co-infects with CMV or PMMoV.
Since F1 hybrid that resistant to PepMoV has not been developed by ordinary breeding method due to lack of genetic source, we have developed transgenic peppers using Agrobacterium-mediated transformation with a Hc-Pro gene of the PepMoV. A large number of GM peppers were tested for resistance to the PepMoV, and after consequent self-crossing up to T4 generation along with pathological test at every generation, a highly tolerant pepper to PepMoV called T20 was selected. So far, BC5F1 lines have been selected by back-crossing with 4 elite lines through a breeding program. Very recently, based on molecular analysis, we have selected another event, #10-2, which is resistant to PepMoV. Horticultural difference was investigated for both #T20 and 10-2, and no significance was found comparing to non-GM lines. We have measured the pollen migration rate by detecting the GM peppers located at different distances. The pollen from GM peppers was not migrated over 30 meter.
The transgenic pepper lines harboring partial HC-Pro gene of the virus were inoculated with the SP6PepMoV-Vb1/GFP and monitored by GFP expression and PepMoV RNA existence was detected by RT-PCR assay. Symptoms of PepMoV and GFP expression in the pSp6PepMoV-Vb1/GFP inoculated transgenic pepper lines were not observed, and the CP gene of PepMoV and the GFP gene were not detected by RT-PCR assay. The introduced genes of transgenic plants were observed the gene’s expression patterns using Southern and Northern blot analyses. The transgenic pepper plants resistance to PepMoV were challenged with other pepper-infecting viruses, which showed symptoms of their viruses. Cytogenetic and genome research through fluorescence in situ hybridization (FISH) of the transgenic peppers was performed to check for possible changes in the plant chromosomes. RNAi vectors based the post-transcriptional gene silencing (PTGS) were designed to produced the dsRNAs for defense system against other pepper-infecting viruses. New antiviral agents against PepMoV could be selected by using a leaf disc assay with the pSP6PepMoV-Vb1/GFP.
The research for new vectors for gene discovery pepper production and transformation was carried out. Pepper was discovering a new promoter and terminator of origin. Were produced by introducing the vector promoter obtained from capsicum, we analyzed the expression through Agroinfiltration. As a result, beta-tubulin, rubisco promoter, and introducing the resulting expression level was the highest.
Developed by introducing a promoter that controls the gene expression vector for RNAi was confirmed that the gene expression level. Pepper-derived promoters to control the expression of the resulting gene was transformed by the introduced RNAi vector.
Results obtained promoter-terminator you may be used for plant transformation, including pepper. Also, be free from patent disputes.
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