보고서 정보
주관연구기관 |
명지대학교 MyongJi University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-02 |
과제시작연도 |
2011 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201500010239 |
과제고유번호 |
1395022387 |
사업명 |
차세대바이오그린21 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500010239 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
RNA 결합단백질과 microRNA에 의한 작물의 생육과 발달 조절 과정에서 전사후 유전자발현 조절은 돌연변이체와 과발현체 분석, RNA의 생화학적 메커니즘 해석, 대량 유전체 정보의 in silico 분석을 수반한다. 본 과제에서는 다양한 연구방법을 이용하여 유전자의 기능을 분석하고 신규 유용유전자, RNA 결합단백질과 상호작용하는 단백질 및 RNA를 발굴하고miRNA에 의한 병저항성 표적유전자를 대량 분석하여 농업적으로 활용할 수 있는 기반을 마련하였다.
1) Puf RNA 결합단백질에 의한 식물발달
Ⅳ. 연구개발결과
RNA 결합단백질과 microRNA에 의한 작물의 생육과 발달 조절 과정에서 전사후 유전자발현 조절은 돌연변이체와 과발현체 분석, RNA의 생화학적 메커니즘 해석, 대량 유전체 정보의 in silico 분석을 수반한다. 본 과제에서는 다양한 연구방법을 이용하여 유전자의 기능을 분석하고 신규 유용유전자, RNA 결합단백질과 상호작용하는 단백질 및 RNA를 발굴하고miRNA에 의한 병저항성 표적유전자를 대량 분석하여 농업적으로 활용할 수 있는 기반을 마련하였다.
1) Puf RNA 결합단백질에 의한 식물발달 조절 메커니즘 규명
애기장대 Puf 유전자 14종의 돌연변이체를 확보하고 각각에 대한 과발현체를 제작하여분석하였다. APUM1, APUM2, APUM3는 종자 발아과정에서 저장단백질 RNA의 분해에 관여하며, 이에 따라 저장단백질 RNA의 decappig과 3’UTR 매개 분해를 조절하였다. 이들 단백질은 세포질의 P-body에 존재하며 발아 유식물에서 높게 발현되었다. APUM18과 APUM19는공통적으로 peroxisome에 존재하지만 APUM18은 암조건, APUM19는 빛이 있는 환경에서 발현되었다. APUM18과 APUM19의 과발현체는 초기 생장이 빠르지만 생육 중기 이후에 잎이variegation 표현형을 보였다. APUM23와 APUM24는 핵인에 존재하며 공통적으로 rRNA 프로세싱에 관여하지만, APUM23 돌연변이체가 엽맥 발달과 생장지연의 약한 표현형을 보이는데반하여 APUM24 돌연변이체는 치사하는 현상을 보였다. APUM24는 female gametogenesis 과정에서 기능을 하지만 꽃가루 발달과는 무관하였다. APUM24는 결핍시 옥신의 불균등 분포,배발생 정지를 야기하는 식물생장에 필수적인 유전자다. 본 연구에 의하여 APUM24는 3‘->5’RNA 분해에 중요한 역할을 하는 exosome cofactor로 새롭게 규명되었다.
2) RNA 결합단백질 ELF9에 의한 조절 타깃 transcriptome 분석 및 유용유전자 대량 발굴
유전자 발현조절 과정에서 NMD(nonsense-mediated mRNA decay)는 매우 중여한 역할을 하지만 유전체 수준에서의 연구는 잘 되어 있지 않다. 선행연구를 통하여 EARLY FLOWERING 9(ELF9)이 NMD에 관여하는 것을 확인하고, 본 연구에서는 ELF 표적 전사체분석과 ELF9에 의하여 매개되는 NMD 메커니즘을 규명하였다. ELF9 돌연변이 애기장대의RNA seq 분석에 의하여 수천종의 유전자의 RNA에서 splicing양상이 변하는 것을 확인하였고,특히, intron-retention 패턴에서 큰 영향이 발생하였다. NMD에 관여하는 단백질은 인 또는 세포질에 모두 존재할 수 있는 것으로 알려졌지만, ELF9은 핵질(nucleoplasm)에 존재하였으며이는 ELF9이 새로운 형태의 NMD에 관여함을 시사한다. 이전에 알려진 NMD 구성단백질 유전자 돌연변이체와 elf9 의 전사체를 비교하여 NMD 표적 전사체의 구조가 매우 유사함을 확인하였다. 이에 따라 본 연구로부터 ELF9이 NMD 매개 전사후조절의 초기단계에 작용하는새로운 인자임을 규명하였다
3) 고추 microRNA 발굴 및 기능 연구
식물에서 microRNA가 식물 생장 및 발달에 핵심적인 역할을 한다는 사실이 밝혀졌으나, 고추의 경우엔 어떠한 microRNA가 있는지 추측하는 수준에 머물러 있었다. 이에 high-througput small RNA sequencing을 통해 고추 microRNA 및 표적 유전자를 대량 발굴하였다. 분석한 표적 유전자의 상당수가 병 저항성에 관여하는 NB-LRR 유전자임을 확인하였고, 고추 조직별 및 가지과 내에서 해당 microRNA 발현 및 보존 양상을 확인하였다. 담배 식물체에서 병 저항성 microRNA 과발현체 제작 실험을 통해 HR-reduced phenotype을 획득하였고 이를 통해 microRNA가 실제 병 저항성 기작에 기능적으로 관여하여, 이러한 양상이 가지과 내에서 보존되어 있음을 규명하였다. 이에 따라 본 연구를 통해 microRNA를 비롯한small RNA들이 고추에서 병 저항성 유전자 조절을 포함하여 생물학적으로 중요한 기능을 가지는 것을 확인하였다.
Abstract
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This study aims to unravel the underlying regulatory mechanism of RNA-binding proteins(RBPs) and micrRNAs during the plant growth and developmental process. To achieve the purpose, we made following efforts; (1) functional analyses of RBPs haboring Puf domains, and identification and roles of protei
This study aims to unravel the underlying regulatory mechanism of RNA-binding proteins(RBPs) and micrRNAs during the plant growth and developmental process. To achieve the purpose, we made following efforts; (1) functional analyses of RBPs haboring Puf domains, and identification and roles of proteins and RNAs interacting with Puf proteins, (2) genome-wide identification of transcriptome regulated by a novel NMD component ELF9, and in planta functions of ELF9 taget transcripts, and (3) in silico analyses of microRNAs in pepper, especially focusing on the NB-LRR genes regulated by micrRNAs.To identify the functions of PUF domain proteins, the mutants and overexpression Arabidopsis for a fourteen Puf genes were extensively examined. APUM1, APUM2, and APUM3 were implicated in the decapping and 3’UTR-mediated degradation of the mRNAs for seed storage reproteins, and thereby regulating seed germination. They are localized in P-body and highly expressed in postembryonic stage.
APUM18 and APUM19 localize in peroxisome in common, and when they were overexpressed ectopically, rosette leaves became variegated. APUM18 was induced by dark, whereas APUM18 was highly expressed under light condition even though they share 97% identity in amino acid sequences. APUM23 and APUM24 localize in nucleolus where they participate in rRNA processing. Although apum23 mutant shows a narrow leaf with a distorted vein pattern, apum24 is embryonic lethal. APUM24 plays a function in female gametogenesis but not in male gametogenesis. apum24 embryo showed abnormal auxin distribution, and eventually arrested at globular stage. APUM24 has been identified as a novel exosome cofactor which recruits the target RNAs destined to decay pathway.Although nonsense-mediated mRNA decay (NMD) acts as a powerful post-transcriptional mechanism for the control of gene expression at global scale, molecular understanding on plant NMD remains very limited.
As we had discovered that EARLY FLOWERING 9 (ELF9) is involved in NMD-mediated post-transcriptional gene control through our previous study, we have attempted to analyze ELF9-target transciptome and understand the molecular mechanism of ELF9-mediated NMD in Arabidopsis. From our RNA seq analyses using wild type and elf9 mutants, we have discovered that the splicing patterns of several thousand genes are affected by the elf9 mutation. Notably, the intron-retention patterns of several hundred genes were altered by the elf9 mutation.Although it is known that most NMD components are localized either into nucleolus or into cytoplasm, ELF9 protein was specifically localized into nucleoplasm, suggesting that ELF9 might be involved in NMD-mediated post-transcriptional control through a novel mechanism. When we compared the transcriptomes of mutants of known NMD components with the transcriptome of elf9,
we found that the structures of most NMD target transcripomes are similarly affected both by the NMD mutations and by the elf9 mutation. Thus, our results indicate that ELF9 is a novel key component of plant NMD machinery that acts at a early step in the NMD-mediated post-transcriptional global gene expression control.MicroRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs approximately 21 nt in length which play important roles in regulating gene expression in plants. Although many miRNA studies have focused on a few model plants, miRNAs and their target genes remain largely unknown in hot pepper (Capsicum annuum), one of the most important crops cultivated worldwide. In this study, we employed high-throughput small RNA and degradome sequencing to comprehensively identify small RNAs and their targets in pepper. From this, we identified several highly abundant 22-nt miRNA families that target conserved domains in NB-LRRs. Furthermore, using transient expression in Nicotiana benthamiana, we showed that co-expression can-miR482 with Rpi-blb1, one of the potato NB-LRRs, resulted in the attenuation of the hypersenstive responses, indicating that these miRNAs have conserved functional roles in NB-LRR regulation in Solanaceae. This work provides the first reliable draft of the pepper small RNA transcriptome that offers an expanded picture of pepper miRNAs in relation to NB-LRR regulation, providing a basis for understanding the functional rolesof miRNAs in disease resistance in pepper.
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