초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
Ⅳ.1. 저장용 마늘 부패 원인균, 길항 미생물 및 천연물질 확보
- 저장용 마늘 종구에 발생하는 부패 원인균을 분리하기 위해 유통되는 마늘로 부터 병원균주를 확보하였으며, 마늘 재배력이 있는 토양으로부터 생리학적, 형태학적으로 차이를 나타내는 약 5,000여종의 미생물들을 분리한 후 길항균을 분리하기 위한 미생물 라이브러리로 사용하였다.
- 분리된 미생물 라이브러리를 사용하여 마늘 부패균과 대치배양을 통해 길항능을 가지는 미생물을 1차적으로 분리하였으며, 이 중 길항력이 우수한 균주 12종을 선발

Ⅳ. 연구개발결과
Ⅳ.1. 저장용 마늘 부패 원인균, 길항 미생물 및 천연물질 확보
- 저장용 마늘 종구에 발생하는 부패 원인균을 분리하기 위해 유통되는 마늘로 부터 병원균주를 확보하였으며, 마늘 재배력이 있는 토양으로부터 생리학적, 형태학적으로 차이를 나타내는 약 5,000여종의 미생물들을 분리한 후 길항균을 분리하기 위한 미생물 라이브러리로 사용하였다.
- 분리된 미생물 라이브러리를 사용하여 마늘 부패균과 대치배양을 통해 길항능을 가지는 미생물을 1차적으로 분리하였으며, 이 중 길항력이 우수한 균주 12종을 선발하였다.
- 선발된 12종의 균주의 실제 부패균이 접종된 마늘에서 부패억제 효과의 검증을 위해 조사한 결과, 8종의 균주를 접종한 마늘에서 부패병이 억제되는 것으로 확인되었다.
- 마늘 부패병 억제능을 가지는 균주는 16S rRNA 유전자 분석을 통해 동정하였으며, 그 결과 Burkholderia sp. 1종, Bacillus sp. 7종, Pseudomonas sp. 3종, Streptomyces sp. 1종으로 동정되었다.
- 또한, 동정된 균주들이 생산하는 항진균 물질의 열안정성을 조사하기 위해 각각의 균주 배양액을 121℃, 15분간 열처리하여 항진균 활성을 측정한 결과, 4종의 균주가 열안정성을 가지는 항진균물질을 생산하는 것으로 확인되었으며, Burkholderia cepacia JBK9 균주의 길항력이 가장 우수한 것으로 조사되었다.
- B. cepacia JBK9 균주가 생산하는 항진균 물질은 GC-MS, NMR 분석 결과, pyrrolnitrin으로 확인되었으며, whole genome sequencing을 통해 B. cepacia JBK9 균주 genome 내에 pyrrolnitrin의 생합성과정에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자가 존재하였다.
- 마늘 종구 부패균에 대한 항진균 활성을 가지는 천연물질을 탐색하기 위해 안전성이 검증되어 있는 천연물질 및 천연물질 유래의 유기산, 식물 면역 활성제, 천연 오일 등을 대상으로 조사한 결과, 계피, 자몽추출액, 황연 등 총 23종의 천연물질이 부패균에 대한 항진균 활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 이중 계피의 활성이 가장 우수한 것으로 조사되었다.
- 또한 B. cepacia JBK9 균주는 식물생장촉진 호르몬인 auxin을 생산하는 것으로 확인되었으며, 실제 pot 상에서 마늘 종구에 균주 배양액을 처리하였을 경우 마늘의 생장을 촉진하는 것으로 확인되었다.
Ⅳ.2. 마늘 부패병 억제능을 가지는 균주의 최적배양 조건 및 제제화
- 마늘 부패균에 대한 길항능이 가장 우수한 B. cepacia JBK9 균주의 최적 배양을 위한 최적 탄소원과 질소원을 조사한 결과, 각각 당밀과 peptone이 첨가된 배지를 사용하여 배양했을 경우 가장 높은 균체 밀도를 나타내는 것으로 조사되었다.
- 선발된 B. cepacia JBK9 균주의 대량배양을 위해 jar-fermenter를 이용하여 최적 배양조건을 조사한 결과, 30℃, 200 rpm, 2.0 Nl/min의 조건에서 가장 높은 균주 밀도로 생장하는 것으로 확인되었으며, 시판되고 있는 배지보다 높은 밀도를 나타내는 것으로 조사되었다.
- 선발된 균주의 제제화를 위한 담체 선별을 위해 최적배지에서 배양한 균주 배양액과 천연담체 및 인공담체 zeolite, NaA-zeolite, HY-zeolite, 규조토(diatomite), sepiolite를 1:2 (v/v)의 비율로 혼합한 후 균주의 생존율을 측정한 결과, zeolite와 혼합한 제제가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
- 최적 배지, jar-fermenter 배양조건에서 배양한 B. cepacia JBK9 균주와 zeolite를 혼합한 제제를 고온 조건인 35℃에서 30주 동안 보관하여 생존율을 측정한 결과, 30주가 경과한 시점에서 106 CFU/ml의 밀도를 유지하는 것으로 확인되었다.
Ⅳ.3. 실증실험을 통한 길항균주의 마늘 부패병 억제능 검증
- 6주간의 실증실험을 통해 길항균주의 마늘 부패병에 대한 효능을 검증한 결과, 부패원인균이 접종된 마늘 종구의 경우, 85%이상 마늘 부패병에 감염되었으나, B. cepacia JBK9과 천연물질인 cinnamic acid를 각각 처리한 종구의 경우 감염률이 10% 미만인 것으로 조사되었다.
- 길항균주 및 천연물질의 방제효과를 증가시키기 위해 마늘 종구의 저장법을 조사한 결과, 망태기 저장법에 비해 묶음 저장법으로 저장 시 감염률이 감소하는 것으로 확인되었다.
- 실증실험 종료 후 마늘의 외적품질인 구폭과 구중량을 조사한 결과, 길항균주와 천연물질을 처리한 종구의 외적품질이 부패원인균을 처리한 종구보다 우수한 것으로 확인되었다.
- 또한, 마늘의 내적품질 요소인 pyruvate와 thoisulfinate의 함량은 외적품질의 패턴과 동일하게 길항균주와 천연물질을 처리할 경우, 비교적 높은 함량을 나타내는 것으로 조사되었다.
- 마늘 종구의 중요한 요소인 저장 후 발아율을 조사한 결과, 길항 균주를 처리한 종구의 경우, 약 92%의 종구가 발아하는 것으로 확인되었다.

Abstract ▼

Ⅳ. RESULTS
Ⅳ.1. Screening of Antagonistic microbes and natural substances for controlling garlic rot disease
- Phytopathogenic fungi such Fusarium was isolated from garlic infected with rot disease for investigating antagonistic bacterial isolates.
- Furthermore, approximately 5,000 microbe

Ⅳ. RESULTS
Ⅳ.1. Screening of Antagonistic microbes and natural substances for controlling garlic rot disease
- Phytopathogenic fungi such Fusarium was isolated from garlic infected with rot disease for investigating antagonistic bacterial isolates.
- Furthermore, approximately 5,000 microbes were isolated based on physiological and morphological difference from garlic farming field.
- Using all the isolated microbes, primary selection was done through screening for antifungal activity against pathogenic fungi. Out of total microbes, only 12 isolates were selected from primary selection based on strong antifungal activity.
- For determination of rot disease control, 12 isolates were inoculated on garlic infected with pathogenic fungi. Rot disease was suppressed in garlic infected with pathogenic fungi which were inoculated with 8 isolates.
- Selected bacterial isolates that had rot disease suppressing activity were identified using 16s rRNA gene and confirmed as one Burkholderia, seven Bacillus, three Pseudomonas, and one Streptomyces species.
- Thermostability of the antifungal substances were confirmed by treating the microbial culture for 15 min at 121℃. After heat treatment, culture was screened for antifungal activity. The result reveal that four microbes produce antifungal substances that has thermostability. Additionally, the antifungal activity of Burkholderia cepacia JBK9 culture was highest among all microbes.
- Candidate compound responsible for anti-fungal activity was isolated and purified through solvent-solvent extraction and subsequent bioassay. The purified compound was identified through GC-MS and NMR. The result of GC-MS, and NMR analysis of the antifungal compound revealed as pyrrolnitrin, produced by B. cepacia JBK9 strains. In the B. cepacia JBK9 strain, the genes coding for the enzymes involved in the biosynthesis of pyrrolnitrin were also confirmed by whole genome sequencing.
- In addition, B. cepacia JBK9 strain was found to produce plant growth promoting hormone auxin, confirmed through Salkowski’s reagent. While growth promoting potential was also checked by treating the garlic seed with bacterial culture broth and it was confirmed that bacterial strain JBK9 promote the growth of the garlic in pot test.
- To explore the natural substances having antifungal activity against garlic rot disease causing fungi. For this purpose, already safety certificated natural substances such as organic acids, plant immunologically active agent derived from natural materials and natural oils were investigated.
- Among all the natural products screened for controlling garlic rot disease, 23 kinds of natural products have antifungal activities against F. oxysporum. While cinnamic acid and grapefruit extract showed highest activity.
Ⅳ.2. Optimization of cultivation conditions and formulation of pathogenic fungal antagonistic B. cepacia JBK9
- Carbon and nitrogen source were used for optimization of growth condition of B. cepacia JBK9 that has best antifungal activity against garlic rot disease fungi. As a result, the highest microbe density was established in case of using a media that contained molasses and peptone as carbon and nitrogen source, respectively.
- For large-scale cultivation of B. cepacia JBK9, optimal cultivation condition were employed while using jar-fermenter. When B. cepacia JBK9 incubated at 30℃, 200 rpm, and 2.0 Nl/min, it showed not only higher growth than other cultivation condition, but also had higher density than incubating at commercial medium.
- In order to select carrier for formulation of B. cepacia JBK9, microbial culture broth was mixed with zeolite, NaA-zeolite, HY-zeolite, diatomite, and sepiolite by 1:2 (v:v). As a result, it was confirmed that cell survival rate of B. cepacia JBK9 in zeolite mixture was higher than other carriers.
- B. cepacia JBK9 in zeolite was stored for 30 weeks at 35℃, and survival rate was measured. The result showed that microbe can survive for long period of time as microbial density was maintained about 106CFU/mL after 30weeks.
Ⅳ.3. Confirmation of suppressing garlic rot disease by antagonistic bacterium using in situ experiment.
- Suppressing garlic rot disease experiment was done by treating garlic with B. cepacia JBK9 and cinnamic acid, respectively, for six weeks. In case of B. cepacia JBK9 treatment, the infection rate of garlic with F. oxysporum was reduced to 10%, whereas, the infection rate was 85% in non-microbial treatment.
- When two different garlic storage methods were tested for increasing their effect on biological control efficiency of B. cepacia JBK9 and cinnamic acid, binding method was better than mesh bag method.
- Furthermore, B. cepacia JBK9 and cinnamic acid treatment not only increased garlic width and weight as external quality, but also improved content of pyruvate and thiosulfinate as internal quality.
- Similarly, germination rate in microbial agent treated garlic was increased as compared with other treatments.