초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
활성질소 특이적 유전자원 확보를 위해 먼저, 활성질소 특이적 전사체(nitrosative stress-specific transcriptome)의 발현양상을 파악할 필요가 있다. 이를 위해 모델식물인애기장대와 주요 재배 작물인 벼 식물체를 대상으로 NO donor인 CysNO(S-nitrosocysteine)을 엽면에 infiltration하여 total RNA를 추출하여 RNA-Seq으로 시퀀싱하여 1차년도 애기장대로부터 NO 특이적 유전전사체 확보(Illumina HiSeq 2000,2x100bp Form

Ⅳ. 연구개발결과
활성질소 특이적 유전자원 확보를 위해 먼저, 활성질소 특이적 전사체(nitrosative stress-specific transcriptome)의 발현양상을 파악할 필요가 있다. 이를 위해 모델식물인애기장대와 주요 재배 작물인 벼 식물체를 대상으로 NO donor인 CysNO(S-nitrosocysteine)을 엽면에 infiltration하여 total RNA를 추출하여 RNA-Seq으로 시퀀싱하여 1차년도 애기장대로부터 NO 특이적 유전전사체 확보(Illumina HiSeq 2000,2x100bp Format-9Gbp- 6samples)를 하였으며, up-regulation된 유전자는 2,900여개,down-regulation된 유전자는 3400여개를 확보하였고, 2차년도에는 벼로부터 NO 특이적유전 전사체(Illumina HiSeq 2000, 2x100bp Format-9Gbp-6 samples)를 확보하였으며up-regulation된 유전자는 700여개, down-regulation된 유전자는 100여개의 활성질소 특이적 유전자원인 transcriNOome을 확보하였다(1,2년차).
활성질소 특이적 유전자원들을 다양한 tool을 이용한 비교유전체학적 기법을 이용하여GO (gene ontology) term 분석 한 결과 NO (nitric oxide)와 백질의 cysteine잔기와공유결합을 하는 단백질질산화(protein S-nitrosylation)과정과 같은 post-translational modification과도 관련이 상당히 높을 것으로 예상된다. 이와 더불어 및 comparative genomics 분석을 통해 약 70 여개의 유전자가 공통적으로 같은 발현양상을 보임으로써, 약 10%의 유전자가 두 종간에 유사한 신호전달역할을 하는 것으로 예상된다. 확보된 유전자원들 중 상당수의 transcription factor들이 존재하고, 기존의 NO marker gene들이 대거 검출되어 향후 작물적용 뿐만 아니라 학문적으로 연구하는데도 유용하게 사용될 것으로 예상된다.
기존의 다양한 활성질소 관련 돌연변이 식물체(애기장대)는 주로 생장 및 발달에 연구초점이 맞추어져 있었으며 병저항성에 대한 연구는 비교적 미흡하였다. 따라서 활성질소특이적 유전자원에 대한 돌연변이식물체(knock out(down), overexpression)을 확보하여종합적 병 저항성 검증을 통해 식물 면역체계 중 NO 신호전달체계를 규명하고자 하였다. 다양한 NO 관련 유전자 중 transcritome 분석 후보유전자 중 특히 그 유전자 발현량이 NO처리에 의해 극도로 저하된 유전자원을 확보하였고, 이들 유전자원들은 기존에 보고 되어있는 SNP-inducible gene profile과 비교하였을 때 총 8개 marker gene 중6개가 본 시퀀싱에서 up-regulation된 것으로 나타났으며 이들 marker gene들 중Zn-Finger family유전자 (At3G53***)는 336배 upregulation된 것을 비롯하여 30배 이상 발현차이를 보이는 50여개 이상 유전자를 확보하였고, 이들 돌연변이체를 중심으로homozygous line을 선별하였다. 선별된 애기장대 돌연변이체를 대상으로 CysNO 처리하여 민감성 및 저항성을 가지는 돌연변이체를 스크리닝을 통해 선별 하였다. 선별된 돌연변이 식물체 중 유전자의 발현량이 124배 증가했던 유전자의 돌연변이체(At1G79***)를 대상으로 식물체가 가지는 기본 방어 시스템 검정을 위해 (Pst)DC3000을 접종하고, 접종 후 식물체에 존재하는 병원균의 수를 확인하였다. 또한 병원성균인 Pst (Pseudomonas syringae pv.tomato) DC3000 strain을 접종하였을 때 atgsnor1-3 및 nox1 mutant에서병에 대한 감수성이 유의적으로 상당히 높은 것으로 나타났다. 즉 체내에 NO가 증가할 경우 basal 병저항성에 부정적 요인으로 작용하는 것으로 판단된다.
또한, 기존에 알려전 다양한 활성질소종 muntant line을 대상으로 rosette 단계에서 내건성 실험을 수행한 결과 atgnosr1-3, nox1 , atgsnor1-3 nox1 double mutant 등과같은 활성질소종 생성량이 높은 식물체에서 현저하게 높은 건조내성을 보였다. 반면에atgsnor1-1, noa1, nia1,atgsnor1-1 nox1 double mutant 등 활성질소생성량이 낮은 개체들은 건조내성에 현저하게 민감한 결과를 볼 수 있었다. 이는 ABA signaling에 의한 기공 닫힘으로 건조내성을 보이는 것으로 사료된다. 특히 atgsnor1-1 nox1 double mutant에서는 nox1 으로 인한 건조내성효과를 전혀 볼 수 없었는데, 이는 atgsnor1-1의 GSNOR1 과도발현기능으로 인하여 nox1 의 높은 NO생성을 적절히 turnover 하는것으로 사료된다.
벼의 경우, 기존 애기장대에서 알려져 있는 NO관련 mutant의 특징적인 phenotype을기준으로 벼에서도 나타날 가능성이 있으므로 효과적인 유전자원을 확보할 수 있을것으로 기대한다. 애기장대에 주로 pale green leaf, dwarfism, apical dominance억제등의 표현형이 나타나는 벼 돌연변이 집단에 대한 주기적인 생육 조사 실시하여 후보계체군 선별하였고, 약 50여종의 벼 transposon 계통선별 하였고, 일부 KO 라인은 다량종자확보위해 모내기 실시하였으며(2, 3차년도). Bacterial Leaf Blight (BLB, 흰잎마름병)를 유발하는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae의 다양한 isolates (K1, K2, K3,K3a)를 이용하여 세포 사멸반응검증 시스템 확립하였다.
식물체 NO signaling 분야에서 선도적인 역할을 하는 그룹(Massimo Delledonne,Gary Loake, Jorg Durner, Zhen-Ming Pei, Nigel Crawford 그룹 등)에서 다양한 연구를 해 오고 있지만, 활성질소 특이적인 transcriptome에 근거한 연구는 아직 발표되지않고 있다. 그리고 현재 활성질소관련 돌연변이체 식물(애기장대)의 건조와 염해에 대한 특성조사 연구와 개화발달에 대한 연구 등이 일부 있으나, 병저항성에 대한 종합적인 연구는 아직 이루어지지 않고 있다. 본 연구 결과를 기반으로 저분자활성물질들의세밀한 기능 차이에 대한 연구를 지속적으로 진행하고 그 기능을 구명함으로써 환경내성작물개발에도 중요한 자료로 사용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Plant defenses against pathogens and abiotic stresses are regulated differentially by communicating signal transduction pathways in which nitric oxide (NO) plays key roles. Plants are able to activate a wide variety of abiotic and biotic resistance mechanisms. However, the genes involved in reactive

Plant defenses against pathogens and abiotic stresses are regulated differentially by communicating signal transduction pathways in which nitric oxide (NO) plays key roles. Plants are able to activate a wide variety of abiotic and biotic resistance mechanisms. However, the genes involved in reactive nitrogen species (RNS) signaling were not studied extensively. RNS involved in plants defense via S-Nitrosylation on cysteine residue of peptides which is a reversible reaction. S-Nitrosylation is important as it regulates or affects the phosphorylation, ubiqutylation, acetylation, sumoylation and palmitoylation. For deep understanding of NO signaling in Arabidopsis and rice, comprehensive transcriptomic analysis was carried out under S-nitrosocysteine (CysNO)-mediated nitrosative stress conditions. Differentially expressed genes (DEGs) were selected from both the plants with cut off p<0.01. Computational and comparative genomics analysis was done in DEGs to select the key players in NO signaling.
A group of genes known as Rapid Alkalization Factor (RALF) have been identified in DEGs that had highly variable expression level among them, which prompted us to understand and investigate the function and structure of these genes. RALF are having conserved four cysteine residues in their peptides which can be a potential target for S-Nitrosylation to play its role in redox signaling. AtRALF genes which have shown fluctuations in expression level in NO treated transcriptomic data were analyzed under CysNO (NO-stress) and H2O2 stress. AtRALF-1 and AtRALF-like31 have shown enhanced expression level among CysNO treated leaves, whereas, AtRALFL-17 as higher level of transcription under H2O2 stress. AtRALFL-2 and AtRALFL-22 have shown comparable transcripts among CysNO and H2O2 treated leaves. To establish organ and tissue specific expression patterns of RALF genes available microarray as well EST databases were scanned.
In general the temporal and tissue specific expression of RALF genes was correlated with floral development. Expression dynamics was also studied along seed development, root growth and leaf maturations in Arabidopsis, rice, maize and soybean RALF genes. Together RALF genes may have important roles in controlling gene expression for setting their progeny as well as in plant defense. AtWALK10 along with other co-expressed genes has been shown to be activated by Cys-NO treatment in transcriptomic data. Loss of function mutation in WAKL10 lead to down regulation in the response to Pseudomonas syringe pv. tomato is thought to be driven by NO stress. Our data also showed a negative role of WAKL10 in drought and salt stress tolerance.
These findings support the role of NO in differential regulation of genes in the signal network controlled by salicylic acid. A major focus of this study is to uncover mechanisms by which plants tailor their responses via NO to different stresses and to investigate how plants cope with simultaneous interactions. In the case of rice, plants were selected based on characteristics of the NO-related mutant phenotype such as pale green leaf, dwarfism, and apical dominance. Approximately 50 species were screened from rice transposon population; some lines were transferred to the field for multiplication. For studying roles of NO-responsive gene against to pathogen in rice, we established hypertensive response verification system using Xanthomonas oryzae pv. Oryzae isolates (K1, K2, K3, K3a). Moreover, transcriptomic data was scanned for identifying the NO synthase (NOS) candidates which is not identified in plants till date.
A comparative genomics analysis was done for prediction of putative NOS between transcriptomic data and eukaryotic NOS genes. Several NOS candidates were identified which further require wet lab screening for NOS identification. This study provide a basis to study the redox signaling under biotic and abiotic stresses, which helps to develop varieties with enhanced resistance to environment fluctuations.