초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1) 1세부 과제 : 이벤트별 기능 평가 및 분자생물학적 특성 분석
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 분자생물학적 특성구명
가뭄저항성 GM벼(Agb0103)를 세대별 육성하여 삽입유전자의 copy수와 안정성에 관한 Southern 분석 수행 및 도입 위치 및 주변 염기서열 분석하였으며, 가뭄저항성 GM벼의 도입 유전자. 포함 운반체의 완결성 확인하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 유전자 및 발현 안전성 검정
연구 수행기간에 육성된 세대별 가뭄저항성 GM벼(Agb0103)를 이용

Ⅳ. 연구개발결과
1) 1세부 과제 : 이벤트별 기능 평가 및 분자생물학적 특성 분석
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 분자생물학적 특성구명
가뭄저항성 GM벼(Agb0103)를 세대별 육성하여 삽입유전자의 copy수와 안정성에 관한 Southern 분석 수행 및 도입 위치 및 주변 염기서열 분석하였으며, 가뭄저항성 GM벼의 도입 유전자. 포함 운반체의 완결성 확인하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 유전자 및 발현 안전성 검정
연구 수행기간에 육성된 세대별 가뭄저항성 GM벼(Agb0103)를 이용하여 선별 마커 유전자 및 backbone DNA의 숙주 미삽입 확인 및 세대별 도입유전자 안정성을 southern blot과 PCR 분석 방법으로 검정하였으며, 유전자 재조합체 내에서의 발현 부위, 발현 시기 및 발현량을 Immuno-strip 분석하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 유전자 안정성 분석
포장/온실 전개에 따른 3세대 이상의 T4 - T6세대 가뭄저항성 GM벼(Agb0103)에 도입된 유전자들에 대한 삽입양상 분석 및 유전자 안정성 분석은 GM벼 DNA 분리, 제한효소 처리 및 gel blotting, CaMsrB2 및 bar 유전자프로브 등을 이용한 southern hybridization, 프로브 signal 분석 및 도입유전자 복제 수 확인, PCR 분석을 이용한 도입 유전자수와 안정성을 검증을 수행하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 근권토양 미생물 비교분석 및 DGGE 분석
포장(수원 농과원 GMO격리포장, 군위 경북대 GMO격리포장)에 일미벼와 가뭄저항성 벼(Agb0103)를 재배하면서 토양 화학성분 분석, 토양미생물 군집밀도 분석,DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 분석을 수행하여 모품종인 일미벼와 가뭄저항성 GM벼(Agb0103)에 대한 벼 토양성분과 토양 미생물에 미치는 영향을 확인하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 가뭄저항성 기능 평가
포장(일반재배조건)과 온실 환경(가뭄처리)에 일미벼와 가뭄저항성벼(Agb0103)를 재배하여 가뭄저항성 기능 검정을 수행하였다. 표준 재배 시험(포장)에서는 벼 표준 재배조건에서 농업형질 평가하였으며, 가뭄처리시험(온실)에서는 유리 온실 이앙, 최고분얼기부터 위조점까지 건조처리 후 농업형질 평가하였다. 주요조사항목은 출수기, 주요 농업형질(수량구성요소, 정조중)를 조사하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 모니터링 검정 기술 개발
가뭄저항성 GM벼를 도입 유전자 특성을 분석한 후, 가뭄저항성 GM벼의 도입 유전자특이적 PCR 검출용 프라이머 제작 및 검정하였고, 개발된 특이적 프라이머를 이용한 가뭄저항성 GM벼와 다른 GM벼들의 선별 PCR 비교 분석을 통해 가뭄저항성 GM벼의 비의도적 환경방출에 대한 모니터링 검정법 확립하였다.
○ 가뭄저항성 벼(Agb0103)의 심사서 작성
각 세부별 생산된 가뭄저항성 벼의 안전성 평가 자료들을 취합하여 가뭄저항성 벼의 심사서 작성 및 제출하였다.
2) 2세부 과제 : 가뭄저항성 벼의 목적단백질 독성 및 알레르기 평가 연구
○ CaMsrB2 단백질 독소 및 알레르기 가능성 검정
독소와의 상동성 분석에서, 상동성이 있는 것으로 나타난 유전자는 대부분 다른 종에서 발견되는 MsrB2 종류였으며, 특별히 독성과 관련된 단백질은 검색되지 않았다. 알레르기와 관련하여, 알레르기 가능성의 지표선인 연속되는 80 아미노산 서열과 35%이상 상동성을 보이는 경우는 없었고, 연속 8 아미노산이 100% 일치하는 경우도 나타나지 않았다.
○ CaMsrB2 단백질 분리 정제 및 N-말단 아미노산 서열 검정
CaMsrB2 단백질을 만드는 유전자를 대장균에서 발현하여 CaMsrB2 단백질을 분리하였다. 단백질의 발현양이 높지 않아 많은 양의 단백질을 확보하는데 어려움이 있었으나, 현재까지 400mg 정도의 단백질을 확보하였다. 대장균을 통해 분리한 단백질의 N-말단 염기서열을 분석한 결과, N-말단 아미노산 서열은 도입된 유전자의 유추된 아미노산 서열과 일치하였으며, 기존에 보고된 CaMsrB2 단백질과 100% 일치함을 확인하였다.
○ Glycosylation 및 열안정성 검정
단백질에 변이가 일어났는지를 보기 위하여 당 단백질 여부를 검정한 결과, 가뭄저항성 벼에서 발현되는 CaMsrB2 단백질은 glycosylation 되어 있지 않음을 알 수 있었다. CaMsrB2 단백질의 열 안정성을 검정 결과, 100℃에서 60분 이상 가열하여도 분해되지 않았고, 열에 의해 비교적 안정한 형태를 유지하고 있었으나, 시간이 경과 할수록 band의 강도가 조금씩 약해지는 현상을 관찰 할 수 있었는데, 이는 열에 완전히 강하다고는 볼 수 없음을 의미한다.
○ CaMsrB2 단백질의 소화기내 안정성 검정
가뭄저항성 벼의 목적단백질인 CaMSrB2에 대해 인공위장액(SGF)과 인공장액 (SIF)에 대한 안정성을 검정한 결과, 최대 30초 이내에 완전히 분해됨을 확인 할 수 있었다.
○ 가뭄저항성 벼 단백질 발현량 검정
가뭄저항성 벼 파종 후, 각 단계별로 잎, 줄기 뿌리, 꽃가루, 종자에 대한 발현양을 검정한 결과, 수원과 군위간의 차이가 보이나, 환경적인 영향에 의한 차이가 발생한 것으로 판단된다. 발현은 조직에 따라 다른 양상을 보였으나, 모든 부위에서 발현되고 있는 것으로 보인다. 종자 자체와 현미, 껍질 및 수술에 대해 분석한 결과, 약간의 차이가 발생하나, 역시 환경적인 영향에 의한 것으로 볼 수 있다.
○ 가뭄저항성 CaMsrB2 단백질 급성독성 및 아만성 독성 검정
CaMsrB2 단백질을 단회 급성독성 평가기준이 2,000mg/Kg 농도로 ICR 마우수에 경구 투여 한 후, 2주간 단백질에 의한 사망 여부, 체중변화 및 이상증상을 조사였다. 그결과, 투여 2 주간 사망한 동물은 암수모두에서 한 마리도 나타나지 않았고, 특별한 이상증상도 나타나지 않았다. 2주간의 생육기간 동안에도 정상적인 체중 증가 및 사료섭취를 확인하였고, 2 주 후 부검 시에도 별다른 이상증상은 발생하지 않았다. 이를 근거로 CaMsrB2 단백질은 평가 기준 이상이니 LD50 수치를 나타낼 수 없고, 충분한 안전성을 가지고 있음을 확인 하였다. 가뭄저항성 벼와 대조구인 일미벼의 종자를 도정하여 현미상태를 만든 후, 이들을 배합하여, 쥐의 영양대사에 맞게 5 가지 군에 맞는 사료를 제작하고, 이를 특정병원균 부재(SPF) Sprague Dawley®™ 랫드에 90일간 투여 한 후,SPF 래트에서 일어나는 현상을 분석하고자 한다. 아직 분석이 완료되지않아서, 49일 간의 사망률, 체중변화 사료섭취율을 조사한 결과, 일반적인 쥐사료를 먹인 G1군 및 일미벼만 포함된 G2군과 비교 했을 때, 가뭄저항성 벼 각 12.5, 25, 50%함유된 G3, G4, G5 군에서 사망률, 체중변화 및 사료섭취량은 유의적인 차이가 발생하지 않았다고 판단된다.
3) 1협동 과제 : 가뭄저항성벼의 농업적 특성 및 포장 환경 안전성 평가
○ 가뭄저항성벼의 농업적 특성
가뭄저항성 벼 Agb0103와 모품종인 '일미', 대조구 품종으로 각 시험별 수량답과 천수답에서 후대 농업적 주요형질 비교한 바, 2013년에는 수량답과 천수답의 출수기는 각 시험별 유사하게 출수되었으나, 천수답에서 가뭄저항성인 Agb0103은 수량답과 유사하지만 모품종인 ‘일미’는 수량답에 비해 천수답 출수일이 3일 늦게 출수하였다. 정조수량에서는 Agb0103이 일미보다 약간 높으나 통계적인 유의성은 없었고, 특히 천수답에서 Agb0103이 726kg/10a로 밀양의 수량답 보다는 높게 났고, 모본인 ‘일미’ 보다는 낮게 조사되었다. 2014년에는 수량답과 천수답의 출수기는 각 시험별 동일하게 출수하였다. 정조수량에서는 Agb0103이 일미보다 낮게 조사되었으나 통계적인 유의성은 없었고, 또한 천수답에서도 비슷한 경향을 나타내었다.
○ 가뭄저항성벼의 포장 환경 안전성 평가
2013년과 2014년에 가뭄저항성 벼의 탈립성을 조사하고자 수량답과 천수답의 출수 50일 후 식물체를 채집하여 조사한바, Agb0103과 모품종인 ‘일미’와 거의 유사한 양상을 보여 주었다. 가뭄저항성 벼의 수량답, 천수답 시험구의 수발아율 조사를 한바, 수발아율에서 내건성 형질전환벼 Agb0103은 모본인 ‘일미’와 비슷하게 조사되었다. 2013년에 시험구 계통에 대한 저온 발아성 양상 비교는 Agb0103이 평균발아속도가 6.07±0.40 모품종인 ‘일미’는 6.31±0.42로 나타나 형질전환 벼가 조금 빠른 편으로 나타났으나 통계적으로는 차이가 없었다. 그러나 2014년에서는 평균발아속도, 평균발아일수 및 발아율이 전반적으로 높게나타났으나, Agb0103과 모품종인 ‘일미’와의 차이는 나타나지 않았다. 0℃에서 출아율 비교도 수량답과 천수답에서는 차이가 없었다. 대규모 GM 필드의 시험구 계통에 대한 월동 후 출아율 비교에서 천수답과 수량답과는 차이가 없었다. 가뭄저항성 벼의 유전자 이동성 조사 결과, 0.19% (53개/28,000개)로 나타났다.
4) 2협동 과제 : 가뭄저항성벼의 비표적 생물체 및 병 발생 영향평가
○ 가뭄저항성벼의 곤충상 및 병발생 조사
가뭄저항성벼(Agb0103)와 모본계통인 '일미'에서의 해충과 천적류 발생에는 통계적 차이가 없는 것으로 분석되다. 병원균의 변이 여부를 확인하기 위하여, 품종별로 분리된 병원균들의 생육적 특성의 차이를 확인하고자 발생된 병원균을 분리, 접종하여 실험을 수행하였으며, 각 품종별에서 분리된 각각의 병원균은 병원균 종에 따라 동일한 병반을 형성하였고, 각 병원균의 병원학적, 배양학적·형태학적 특성에서 차이가 없었다.
○ 가뭄저항성벼의 비표적 생물체 영향 평가
가뭄저항성 GM벼(Agb0103)과 non-GM벼인 일미벼 두 품종에서의 벼멸구 습식선호도, 산란선호도 및 부화율은 통계적으로 차이가 없는 것으로 분석되었다.
가뭄저항성벼 유전자의 단백질 노출이 물벼룩, 잉어 및 미꾸리 등 환경지표생물의 급성독성시험에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.
5) 3협동 과제 : 가뭄저항성 벼의 영양성분 및 항영양소 평가
○ 가뭄저항성벼의 영양 성분 및 항영양소 비교 분석
국내에서 개발되어 내건성을 갖도록 형질전환된 가뭄저항성 벼와 그 모종 벼인 일미벼로부터 쌀(현미)의 일반성분, 지방산, 아미노산, 무기질, 비타민 함량 등 벼의 총체적인 영양성분을 분석하였으며 phytic acid, trypsin inhibitor 등 항영양소를 분석하여 가뭄저항성 벼에서 영양성분의 조성에 차이가 있는지를 비교하였다. 벼는 수원과 군위 2개 재배지에서 2012년과 2013년 2차년에 걸쳐 재배한 가뭄저항성 벼를 사용하였다. 또한 가뭄저항성 벼의 사료용 이용을 위해 식물체(잎, 줄기)에 대한 영양성분을 분석하였다. 가뭄저항성 쌀은 모종 쌀과 일반성분 함량에 유의적인 차이가 없었으며, 지방산, 아미노산, 무기질, 비타민 함량에서 차이가 없는 것으로 평가되었으나 재배지역간 일부 아미노산, 무기질 함량에서 다소간의 차이가 있어 재배환경이 차이를 줄 수 있는 것으로 나타났다. 식물체(잎, 줄기)에 대한 영양성분에서 가뭄저항성 벼와 일미벼 사이에 유의적인 차이가 없었다. 따라서 본 연구를 통해 가뭄저항성 벼는 그 모품종인 일미벼와의 총체적인 영양성분에서 실질적 동등성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
6) 4협동 과제 : 가뭄저항성 벼의 생리학적 특성 및 국외포장 검정
○ 가뭄저항성 GM벼의 현지 생육특성 및 생리학적 특성 분석
국내 벼 품종(일미, 동진)의 현지(파키스탄) GM포장과 연구실에서 생육특성을 분석하였다. 다양한 염처리 조건(0, 75, 150 및 225 mM NaCl)에서 국내 벼품종의 생육특성 분석하기 위하여 뿌리(root), 줄기(shoot) 및 유식물체(seedling)의 길이를 확인하였다. 가뭄저항성 CaMsrB2 이벤트(L-8, L-23[Agb0103])는 건조처리 조건에서 WT과 비교하여 건조에 저항성을 보였고, 높은 생체량과 상대수분함량을 나타났다. CaMsrB2 이벤트(L-8, L-23[Agb0103])는 광합성 색소함량, dark adapted quantum yield (Fv/Fm Ratio), performance index (PIABS), photochemical quenching (qP) 그리고 stomatal conductance 등 모든 생리실험에서 WT과 비교하여 높은 건조저항성을 나타났다. 이는 기존의 연구결과와 일치하며 현지 생육포장에서도 CaMsrB2 이벤트(L-8, L-23[Agb0103])가 건조저항성을 보인다는 것을 의미한다.
○ Halophyte 종자 수집 및 염 처리에 따른 생리적 특성 분석
수집된 Halophyte 종자 중 Halopyrum mucronatum은 계절형에 따라 brown seed와 black seed로 구분됨. 이들 종자간의 생화학적 특성분석을 수행하였다.
Halopyrum mucronatum (L.)과 Cenchrus ciliaris (L.)를 사용하여 건조 처리시 생리적 특성분석을 수행하였다. 생체량(Biomass), 상대수분함량(RWC), 광합성 색소함량, dark adapted quantum yield (Fv/Fm Ratio), performance index (PIABS), photochemical quenching (qP) 그리고 stomatal conductance 등 거의 모든 생리실험에서 Halopyrum mucronatum (L.)가 높은 건조저항성을 보임. 따라서, Halopyrum mucronatum (L.)가 건조저항성 유전자원을 분리하기에 좋은 halophyte로 판단된다.

Abstract ▼

Genetically modified (GM) crops have been developed worldwide through the recombinant DNA technology and commercialized by various agricultural biotechnology companies. Commercialization of GM crops will be required the assessment of risk associated with the release of GM crops. The purpose of this

Genetically modified (GM) crops have been developed worldwide through the recombinant DNA technology and commercialized by various agricultural biotechnology companies. Commercialization of GM crops will be required the assessment of risk associated with the release of GM crops. The purpose of this research is a molecular characterization of introduced T-DNA in transgenic rice T4 ∼ T6 generation lines harboring a pepper MsrB2 gene under the control of stress inducible Rab21 promoter, as a part of biosafety evaluation for drought-tolerant transgenic rice (Agb0103). We identified the structure and sequence of transformation vector of T-DNA and analyzed insertion sites, flanking sequences, and generational stability of inserted T-DNA in transgenic rice lines. The transformation vector was consisted of right border, a drought-tolerant CaMsrB2 gene unit (Rab21 promoter:CaMsrB2:PinI I terminator), a selectable marker herbicide resistance unit (CaMV 35S promoter:bar:Nos terminator), and left border in sequential order. Based on the adaptor-ligation PCR and whole genome sequence database, we confirmed that T-DNA was introduced 2 copies (head to head type) at the position of 2,471,957-2,472,049 bp of chromosome No. 8. From the generational stability study, T-DNAs were stably inherited through the T4 to T6 generations, and also stable expression of bar gene from T-DNA was confirmed. It was also confirmed that the backbone DNA of transformation vector containing antibacterial gene was not present in Agb0103 rice genome. These results will be filed to biosafety assessment document of Agb0103.
Genetically modified crops are becoming an increasingly important feature of the agricultural landscapes. We developed drought-tolerant Agb0103 rice using the camsrb2 gene. The novel gene product expressed in the genetically modified crops need to be evaluated for the potential toxicity and allergenecity before their introduction into the food chain to address the safety concerns of consumers for commercialization. The aim of the study was to assess the safety of methionine sulfoxide reductase B2(CaMsrB2) protein as toxicity, allergenecity and identity of inserted gene product that transformed rice. In order to support the food safety assessment of drought-tolerant Agb0103 rice containing CaMsrB2 protein, After the purifying CaMsrB2 protein from bacterial expression, we performed acute and subchronic toxicity test. Following the OECD guideline 423, 2,000mg/Kg body weight protein were injected as oral administration. After 2 weeks, there did not shown any death and special symptoms. The CaMsrB2 protein does not possess the characteristics associated with food allergens, and no posttranslational change. The CaMsrB2 protein can be rapidly degraded in gastric and intestinal fluids and heat treatment at 100 ℃. In conclusion, there is a reasonable certainty of no harm resulting from the inclusion of the CaMsrB2 protein in human food or animal feed.
The significance of environment change and genetic safety has been recently recognized by many GM plants(Agb0103). This study was to evaluate the safety of drought-tolerant rice and to identify the environment variance. The Agb0103 of drought-tolerant rice and four check cultivars were analyzed the data on agronomic characters and principal component in large-GM crop field. There was no significant difference in agronomic characters between the drought-tolerant rice and donor plant, ‘Ilmi’. Grain yield showed the standard deviation of the difference, did not significant statistically. Related to grain characters, grain appearance were similar to the drought-tolerant rice and donor plant, ‘Ilmi’. In Chemical characters, brown rice of the drought-tolerant rice and a donor plant, ‘Ilmi’ did difference in starch and protein, however, was similar as 'Ilpum'. The analysis of investigation field of gene flow in encouraging rice was evaluated by measurement of wind direction and maximum wind speed with strip bar method since heading stage. The Basta-resistance was 0.19%. Total 160 kg of rice was harvested in each for food properties analysis and conservation of lines for test in GM rice. The safety evaluation in GM rice and cooperation system in each detailed assignment and infrastructure were built.
During 2013-2014, we surveyed effect on various natural enemy and insect, incidence of major disease, variation of pathogens comparing between drought resistance transgenic rice (Agb0103) and non-transgenic rice (Ilmi). The survey was conducted 8 times per year with 2 weeks interval from initial growth to pre-harvest period. As the results, there were no significant differences in the occurrence of insect pest, natural enemy and incidence rate of Rice blast, Brown spot, Bakanae, Sheat blight and False smut between drought resistance transgenic rice (Agb0103) and non-transgenic rice (Ilmi). To check the variation of pathogens, we isolated each of pathogens from Brown spot and Sheat blight diseased leaves. We inoculated Cochliobolus miyabianus and Rhizoctonia solani which isolated from drought resistance transgenic rice (Agb0103) and non-transgenic rice (Ilmi) on healthy Ilmi rice. As the result, appeared symptoms, morphological and cultural characteristics were identical regardless of GM and Non-GM rice. Therefore, it was revealed that drought resistance transgenic rice (Agb0103) does not effect to occurrence of insect and natural enemy, and there were no differences of disease incidence rate and isolated pathogens between drought resistance transgenic rice (Agb0103) and non-transgenic rice (Ilmi).
As a part of the safety assessment of new transgenic crops, compositional equivalence studies between transgenic crops with non-transgenic comparators are almost universally required. This study was conducted to compare the nutritional profile (proximate composition, fatty acids, amino acids, minerals and vitamins) and anti-nutrients between transgenic drought-tolerant rice with a pepper methionine sulfoxide reductase B2 gene (CaMsrB2) and its parental rice cultivar, 'Ilmi' as a non-transgenic control. Both transgenic and non-transgenic rice were grown and harvested in two different locations, Gunwi and Suweon in Korea. Proximate composition (moisture, starch, protein, lipid, and ash) of the transgenic drought-tolerant rice was similar to that of the parental non-transgenic rice. There were no significant differences between the transgenic and non-transgenic rice with respect to their whole nutritional composition, except for minor locality difference in a few nutritional components. This result indicates that the transgenic drought-tolerant rice with improved resistance to drought is nutritionally equivalent to the parental rice cultivar.
Physiological performance of two Korean rice cultivars viz. Ilmi and Dong-Jin were examined in saline environment. Salinity caused a substantial decline in seed germination of two tested cultivars with considerable variations among them. Among the cultivars, Dong-Jin appeared to be more sensitive at germination stage compared to Ilmi. Similarly, in saline environment, seedling height, root and shoot biomass and root/ shoot biomass ratio was lower in Dong-Jin than Ilmi. While varietal differences in both the cultivars were evident at the highest NaCl (225mM) concentration for most of the considered growth parameters. Antioxidant enzymes activities were also observed and discussed in relation to physiological mechanism of stress tolerance. Dong-Jin exhibited a decrease in superoxide dismutase (SOD) activity and an increase in peroxidase (POX) activity under salinization. However, Ilmi showed only slight increase in SOD and decrease in POX activity in saline environment. Salt stress preferentially enhanced the content of H2O2 as well as the activities of the SOD and ascorbate peroxidase (APX), whereas it caused a reduction in catalase (CAT) activity.