보고서 정보
주관연구기관 |
인하대학교 산학협력단 InHa University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-02 |
과제시작연도 |
2014 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201500010691 |
과제고유번호 |
1395035153 |
사업명 |
차세대바이오그린21 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500010691 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1. NPP 폴리엔 화합물의 다활성 생리활성 분석
신규 폴리엔 화합물 NPP의 항진균 활성을 확인하기 위하여 3종의 진균 (Candida albicans, Aspergillus niger , Mucor hiemalis)을 대상으로 실험을 진행하였으며, 두 개의 당을 가지고 있는 NPP의 항진균 활성이 한 개의 당을 가지고 있는 nystatin의 항진균 활성과 유사함을 확인할 수 있었으며, 이는 NPP 화합물의 특이적인 두 번째 당 (N-acetylglucosamine)이 (진균의 종류에 따라) 항진균 활
Ⅳ. 연구개발결과
1. NPP 폴리엔 화합물의 다활성 생리활성 분석
신규 폴리엔 화합물 NPP의 항진균 활성을 확인하기 위하여 3종의 진균 (Candida albicans, Aspergillus niger , Mucor hiemalis)을 대상으로 실험을 진행하였으며, 두 개의 당을 가지고 있는 NPP의 항진균 활성이 한 개의 당을 가지고 있는 nystatin의 항진균 활성과 유사함을 확인할 수 있었으며, 이는 NPP 화합물의 특이적인 두 번째 당 (N-acetylglucosamine)이 (진균의 종류에 따라) 항진균 활성에 영향을 주지 않음을 암시하는 고무적인 결과를 얻을 수 있었다.
폴리엔계 항진균제는 높은 간 독성을 보인다는 점에 착안하여, 인체 유래의 간암 세포3종 (HepG2, Huh-7, Hep3B)을 이용하여 MTT assay를 진행하였다. 세포 종류에 따른 MIC50값은 다소 차이를 보이기는 했으나, 모든 세포에서 nystatin이 가장 낮은 MIC50 값을 보였으며 NPP가 가장 높은 MIC50 값을 나타냄으로써 NPP < mannosyl nystatin < nystatin의 순으로 세포 독성이 높음을 확인할 수 있었다. 이는 두 번째 당의 추가가 세포 독성을 감소시키는 원인이 될 수 있으며, 두 번째 당의 종류에 따라 독성이 감소되는 정도가 달라질 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, NPP와 nystatin의 in-vivo에서의 약동력학적 특성을 파악하기 위하여 SD rat에서 정맥 및 경구 투여 후에 plasma concentration-time profile 및 PK parameter를 측정하였다. 그 결과, 두 개의 당을 가지고 있는 NPP의 PK parameter는 하나의 당을 가지고 있는 nystatin과 거의 동일하였으며, 이를 통해 폴리엔 구조에서의 당의 첨가는 PK parameter를 변화시키지 않음을 알 수 있었다.
NPP와 대조 약물인 nystatin을 ICR 계통의 암수 쥐에 단회, 반복 정맥 투여함으로써 나타난 개략적인 NPP의 반수 치사량 (letal dose 50, LD50)은 수컷에서 15.504mg/kg, 암컷에서 17.063mg/kg으로, 암수 합쳐 16.131mg/kg으로 산출되었다. Nystatin의 반수 치사량은 수컷에서 5.167mg/kg, 암컷에서 5.682mg/kg으로, 암수 합쳐 5.376mg/kg으로 산출되었다. 따라서, NPP는 nystatin에 비해 낮은 독성을 보이는 것이 확인되었다. 또한, NPP 및 nystatin의 독성학적인 변화가 관찰되지 않는 최대내성용량(Maximum tolerance dose, MTD)은 암수 모두에서 각각 5~10mg/kg, 2~4mg/kg 사이에 존재할 것으로 판단하였으며, 7일간 반복 정맥 투여 실험 결과를 통해 NPP가 nystatin에 비해 더 낮은 독성을 보임을 다시 한 번 확인할 수 있었다.
2. NPP 특이적인 효소 특성 규명 및 이를 기반으로 한 신규 폴리엔의 개발
1차년도 연구를 통해 확보한 P. autotrophica의 전체 유전체 정보를 기반으로 두 번째 당 전이에 관여하는 신규 효소 (NppY)의 특성을 규명하고자 하였다. Targeted gene disruption 기법을 이용하여 NppY를 기능적으로 비활성화 시킨 결과, NPP 생합성 과정에서 두 번째 당(N-acetylglucosamine)이 전이되지 못하여 10-deoxynystatin이 축적되는 것이 관찰되었으며, 방선균 삽입 벡터인 ermE*pSET 152 기반으로 NppY 기능을 보상하였을 경우 NPP 의 생산이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 실험을 통해 신규 당 전이효소인 NppY가 NPP 생합성 과정에서 두 번째 당(N-acetylglucosamine)의 전이에 관여하는 NPP 특이적인 당 전이 효소임을 확인할 수 있었다.
NppY의 구조를 예측하고 특성을 규명하기 위해 기존에 구조가 밝혀진 TDP-vancosaminyltransferase, GtfD와 NPP 생합성 과정에서 첫 번째 당 전이에 관여하는 NppDI의 아미노산 서열을 비교, site-directed mutagenesis 기법 및 hybrid fusion 단백질 구축을 통하여 효소를 변형시킨 결과, NppY의 200번째 아미노산 (Arginine)은 NppY가 NPP 생합성 과정에서 두 번째 당 전이에 관여하는 당 전이효소로서 역할을 하는 데 중요한 요소임을 확인할 수 있었다. 또한, NppDI에는 존재하고 NppY에는 결여되어있는 연속된 7개의 아미노산의 존재 여부가 NppDI과 NppY의 역할을 구분짓는 중요한 요인이 될 수 있음을 확인할 수 있었다.
NPP 특이적 신규 당 전이효소로 밝혀진 NppY를 기존 폴리엔 생합성 균주인 S.noursei (nystatin 생산 균주)와 S. nodosus (amphotericin 생산 균주)에 방선균 삽입 벡터엔 ermE*pSET 기반으로 도입 및 발현하였으나, 두 개의 당을 포함한 신규 폴리엔 유도체를 확인할 수 없었기 때문에 폴리엔 생합성 과정에서의 post-PKS mechanism (당 전이 효소와 수산화효소의 작용 기작 및 순서)이 규명될 필요가 있다고 판단, NPP 생산 균주인 P.autotrophica를 기반으로 당 전이효소와 수산화효소의 기능이 상실된 다양한 균주의 구축 및 , NppDI, NppY 및 NppL의 순차적인 보상을 통해 NPP 생합성 과정은 첫 번째 당인 mycosamine이 NppDI에 의해 전이된 후, 두 번째 당인 N-acetylglucosamine이 NppY에 의해 전이되고, 10번 탄소에 -OH기를 도입하는 수산화효소가 작용함으로써 생합성 과정이 완료됨을 알 수 있었다.
3. NPP 고생산성 균주 구축
P. autotrophica의 전체 유전체 내에서 in-silico 분석을 통해 방선균 유래의 유용 이차대사산물 생산과 형태적 분화에 관여하는 wblA와 49%의 identity를 가지는 wblA ortholog(wblApau)를 발견하였고, targeted-gene disruption&complementation 기법을 이용하여 down-regulator인 wblApau가 기능적으로 제거된 균주에서의 NPP 생산이 약 80% 증가됨을 확인함으로써, 조절 네트워크 최적화를 통한 NPP 생산 향상이 가능함을 확인할 수 있었다.
4. 5L bioreactor를 이용한 scale-up과 NPP 추출 및 분리․정제
NPP 화합물의 분리정제 시스템은 n-butanol shaking 방법을 통해 이루어지며, Amberlite® XAD16N resin(Sigma)을 이용한 방법, 즉 배양액과 동량의 n-butanol을 사용하는 기존 방법에 비해 더 적은 n-butanol양을 사용함으로써 추출 시간의 단축이 가능케하였다. 이 후 C18-reverse phase silica column과 methanol(mobile phase)을 이용한 총 2단계의 분리정제 과정을 통해 최종적으로 90% 이상의 high-purity NPP화합물을 확보할 수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해 구축된 NPP 생산 및 분리정제 시스템은 신규 폴리엔 화합물의 생리활성 분석을 위한 고순도 폴리엔 화합물 확보 기술의 기반을 마련하였다고 사료된다.
Abstract
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Compared with nystatin (which has a single sugar moiety), a novel polyene compound NPP containing the di-sugar identified in a rare actinomycetes, Pseudonocardia autotrophica KCTC9441, exhibits similar antifungal activities against three most common species of fungal pathogens and identical PK param
Compared with nystatin (which has a single sugar moiety), a novel polyene compound NPP containing the di-sugar identified in a rare actinomycetes, Pseudonocardia autotrophica KCTC9441, exhibits similar antifungal activities against three most common species of fungal pathogens and identical PK parameters in SD rats, while reduced toxicity. Although the nppDI was proved to be responsible for the transfer of first polyene sugar, mycosamine in NPP biosynthesis, the gene responsible for the second sugar extending glycosyltransferase (GT) as well as NPP post-PKS tailoring mechanism remained unknown. Here, we identified a NPP-specific second sugar extending GT gene named nppY, located at the edge of the NPP biosynthetic gene cluster. Targeted nppY gene deletion and its complementation proved that nppY is indeed responsible for the transfer of second sugar, N-acetyl-glucosamine in NPP biosynthesis. Site-directed mutagenesis on nppY also revealed several amino acid residues critical for NppY GT function. Moreover, a combination of deletions and complementations of two GT genes (nppDI and nppY) and one P450 hydroxylase gene (nppL) involved in the NPP post-PKS biosynthesis revealed that NPP aglycone is sequentially modified by the two different GTs encoded by nppDI and nppY, respectively, followed by the nppL-driven regio-specific hydroxylation at the NPP C10 position. These results set the stage for the biotechnological application of sugar diversification for the biosynthesis of novel polyene compounds in actinomycetes. Also, to improve the NPP productivity in P. autotrophica, wblApau was isolated and identified as a novel negative regulatory gene for NPP production in P.autotrophica, which showed approximately 49% amino acid identity with global antibiotic down-regulatory gene, wblA identified from various Streptomycetes species. While no significant difference in NPP production was observed between P.autotrophica harboring empty vector and the S.coelicolor wblA under its native promoter, approximately 12% less NPP was produced in P. autotrophica expressing the wblA gene under strong constitutive ermE* promoter. Furthermore, disruption of the wblApau gene from P. autotrophica resulted in an approximately 80% increase in NPP productivity. These results strongly suggest that identification and inactivation of global antibiotic down-regulatory gene wblA ortholog is a critical strategy for improving secondary metabolite over-production in not only Streptomyces but also non-Streptomyces rare actinomycete sspecies.
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