초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
인플루엔자 바이러스 유전자 (M1, M2, HA, NA)를 질병관리본부로부터 분양받은 H1N1 인플루엔자 바이러스 병원체 자원으로부터 확보하고 인플루엔자 바이러스 유전자 단일, 다중 발현 및 범용백신용 M2e 백신소재 발현을 위한 곤충세포 발현시스템에 클로닝한 후 곤충세포에서 각 유전자의 발현을 확인하였다. 인플루엔자 바이러스 유전자 단일, 다중 발현시스템 및 범용백신용 M2e 발현시스템이 안정적으로 형질전환된 양배추 은무늬 밤나방 Trichoplusia ni BT1 TN-5B1-4 (TN-5B1-4) 곤충세

Ⅳ. 연구개발결과
인플루엔자 바이러스 유전자 (M1, M2, HA, NA)를 질병관리본부로부터 분양받은 H1N1 인플루엔자 바이러스 병원체 자원으로부터 확보하고 인플루엔자 바이러스 유전자 단일, 다중 발현 및 범용백신용 M2e 백신소재 발현을 위한 곤충세포 발현시스템에 클로닝한 후 곤충세포에서 각 유전자의 발현을 확인하였다. 인플루엔자 바이러스 유전자 단일, 다중 발현시스템 및 범용백신용 M2e 발현시스템이 안정적으로 형질전환된 양배추 은무늬 밤나방 Trichoplusia ni BT1 TN-5B1-4 (TN-5B1-4) 곤충세포를 확립하고 인플루엔자 바이러스 구조단백질의 발현을 최적화하였다. 인플루엔자 바이러스 M1, M2, NA 및 HA 유전자 4개가 동시에 발현되는 재조합 TN-5B1-4/M1-M2-NA-HA 곤충세포에서 VLP를 생산하고 생성된 VLP를 30% sucrose cushion 원심분리, sucrose density gradient 원심분리 방법으로 분리하고 전자현미경 관찰을 통해 구조를 확인하였다. 또한 인플루엔자 바이러스 M1과 6M2e-HA-TMD 유전자가 동시에 발현되는 재조합 TN-5B1-4/M1-6M2e-HA-TMD 곤충세포에서 범용백신용 M2e VLP를 분리정제하고 VLP의 생성을 전자현미경 관찰을 통해 확인하였다. 인플루엔자 구조단백질 또는 범용백신용 M2e 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제조하고 M1, M2 유전자를 발현하는 재조합 TN-5B1-4/M1-M2 곤충세포 또는 TN-5B1-4 곤충세포에 감염시킨 후 인플루엔자 바이러스 유전자 발현에 의한 VLP, 범용백신용 M2e VLP 생성을 확인하였다. 형질전환된재조합 곤충세포 및 재조합 배큘로바이러스 시스템을 통한 VLP, 범용백신용 M2e VLP 생산비교하여 VLP 생산을 위한 최적 시스템을 도출하였고 VLP 및 범용백신용 VLP 생산을 최적화하기 위한 세포배양 연구를 수행하였다. 또한, 항원백신 VLP 및 범용백신용 M2e VLP 항원 백신을 생산하기 위한 Spinner flask 생물반응기에서 세포배양 연구 및 VLP 생산 연구를 수행하여 인플루엔자 바이러스 VLP, 범용백신용 M2e VLP 백신소재 대량 생산을 위한 기초연구를 수행하였다.
인플루엔자 바이러스 백신소재 백신화 연구를 위해 인플루엔자 바이러스 M2 단백질을 이용한 동물면역실험을 수행하였고 인플루엔자 바이러스 항원단백질의 항원성 검증 체계를 확립하였다. 또한 항원단백질에 대한 일반항체가와 중화항체가를 측정하기 위한 인플루엔자 바이러스 배양과 역가측정을 위한 TCID₅₀, Proinflammatory cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10등) 측정법 및 항원 특이적인 적응 면역 (CD4/CD8)을 조사하기 위한 유세포분석 검사법을 확립하였다. 인플루엔자 바이러스 VLP 백신소재 및 범용백신용 M2e VLP 백신소재를 이용한 동물 면역실험에서 채취한 혈청에는 VLP (M1, M2, NA, HA) 항원 및 범용백신용 M2e VLP 항원을 인지하는 항체가 존재하였고 IL-5, IL-6 사이토카인의 분리를 촉진하였다. 또한 동물 면역 실험에서 형성된 VLP 백신소재 및 범용백신용 M2e VLP에 대한 중화항체 형성능 조사를 통해 체액면역원성 확인하였다.
국내 인플루엔자 감염 환자로부터 바이러스 분리 및 배양을 통해 총 75 주의 인플루엔자 바이러스를 확보하여 인플루엔자 VLP 개발을 위한 자원을 확보하였고 바이러스 은행을 구축하였으며 인플루엔자 바이러스 유전자 (M1, M2, HA, NA 등) 61 클론을 확보하고 염기서열을 분석하였다. 인플루엔자 바이러스 유전자를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제조하기 위한 pFastBac 발현시스템을 구축하였고 재조합 배큘로바이러스 bacmid 및 재조합 배큘로바이러스를 제작하고 곤충세포에 감염시킨 후 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질의 발현을 확인하였다. 또한 인플루엔자 바이러스 유전자 기능 분석을 위한 발현 단백질의 카이네틱스 연구 및 in vitro 발현 검증 등을 수행하여 차세대 인플루엔자 백신소재 생산을 위한 원천 기술을 확보하고자 하였다.

Abstract ▼

IV. Results
Influenza virus genes (M1, M2, HA, NA) were amplified from the RNA genome of influenza virus A/Korea/01-2-9/2009 (H1N1), which was provided from Center for Genome Science, National Institute of Health (Korea). Influenza virus genes were cloned into insect cell expression vectors. The

IV. Results
Influenza virus genes (M1, M2, HA, NA) were amplified from the RNA genome of influenza virus A/Korea/01-2-9/2009 (H1N1), which was provided from Center for Genome Science, National Institute of Health (Korea). Influenza virus genes were cloned into insect cell expression vectors. The expressions of influenza virus genes were confirmed from transiently transfected insect cells. Stably transfected Trichoplusia ni BT1 TN-5B1-4 (TN-5B1-4) cells were generated after transfection with insect cell expression vectors harboring influenza virus genes and selection. The expressions of influenza viral genes was further optimized from stably transfected TN-5B1-4 cells. Influenza virus M1, M2, NA and HA genes were simultaneously expressed from TN-5B1-4/M1-M2-NA-HA cells. VLPs consisting of M1, M2, NA and HA were purified after 30% sucrose cushion centrifugation followed by sucrose density gradient centrifugation, and the structure was confirmed by the electron microscopic observation. M2e VLPs consisting of M1 and 6M2e-HA-TMD were also purified after 30% sucrose cushion centrifugation followed by sucrose density gradient centrifugation, and the structure was confirmed by the electron microscopic observation. Recombinant baculoviruses (rBac/M1, rBac/M2, rBac/HA, rBac/NA, rBac/6M2e-HA-TMD) were generated and infected into TN-5B1-4 or TN-5B1-4/M1-M2 cells. The production of M1-M2-HA-NA VLP and M2e VLP was confirmed by the electron microscopic observation after purification. The VLP production rates were compared from stably transfected insect cells and recombinant baculovirus-infected insect cells to obtain an optimal production system. The VLP production was also optimized by cell culture experiments. A basic experiments for the mass production of influenza VLP and universal M2e VLP vaccine materials were performed in Spinner flask bioreactor.
For the vaccination studies of influenza virus vaccine materials, animal immune experiment was performed with influenza virus M2 protein. Methods for antigenicity analysis, proinflammatory cytokine analysis, flow cytometry analysis, and TCID₅₀ were established to determine the immune response against influenza virus vaccine materials. Serum obtained from mice immunized with influenza VLP and universal M2e VLP vaccine materials contained specific IgG antibodies indicating influenza viral antigens. The immunization of influenza VLP and universal M2e VLP vaccine materials enhanced the expression of proinflammatory cytokines, IL-5 and IL-6. Also, influenza VLP and universal M2e VLP vaccine materials elicited neutralizing antibodies responses against influenza virus.
To secure the resources for the development of influenza VLP, a total of 75 domestic influenza virus was isolated from flu patients. The 61 gene clones including influenza virus genes (M1, M2, HA, NA, etc.) were identified and sequenced. pFastBac expression systemwas constructed for recombinant baculoviruses expressing influenza virus genes. Recombinant baculoviruses were generated and the expression of influenza viral proteins was determined from recombinant baculoviruses-infected insect cells. Also, to obtain a basic technique for producing next-generation influenza vaccine materials, kinetics and in vitro expression analysis were performed with influenza viral proteins.