초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
A. 포괄적 miRNA Sponge의 제작
1차년도 연구를 통하여 타겟 miRNA 4가지 (miR-155, miR-21, miR-221, miR-22)를 선정하였음. 이를 바탕으로 sponge를 디자인 하였는데, 각 miRNA가 결합할 수 있는 MBS (miRNA Binding Site)를 연속으로 배열하되 각 MBS사이에 spacer를 넣어주고 양쪽 끝에는 SanDI linker를 연결하여 한쪽 방향으로 multimerization이 일어나도록 하였음. 또한 miRNA에 완벽하게 상보적인 perfect

Ⅳ. 연구개발결과
A. 포괄적 miRNA Sponge의 제작
1차년도 연구를 통하여 타겟 miRNA 4가지 (miR-155, miR-21, miR-221, miR-22)를 선정하였음. 이를 바탕으로 sponge를 디자인 하였는데, 각 miRNA가 결합할 수 있는 MBS (miRNA Binding Site)를 연속으로 배열하되 각 MBS사이에 spacer를 넣어주고 양쪽 끝에는 SanDI linker를 연결하여 한쪽 방향으로 multimerization이 일어나도록 하였음. 또한 miRNA에 완벽하게 상보적인 perfect match와 실제 target에서 빈번히 관찰되는 Bulged match를 모방한 MBS를 가지는 sponge를 제작하였음. 이렇게 만든 Sponge들을 pmiReport라고 하는 luciferase reporter벡터에 도입하였고 sequencing을 통하여 perfect match는 3개까지, 그리고 bulged match는 5개까지 multimerization이 일어난 sponge를 얻었음.
B. 유방암과 췌장암 세포주에서 miRNA sponge의 작용 검증
이 sponge가 암세포에서 잘 작동하는지를 알기 위하여 2가지의 유방암 세포주와 2가지의 췌장암 세포주를 이용하였음. 위에서 제작된 prefect와 bulged sponge를 암 세포주에 transfection한 뒤 luciferase assay를 통하여 Empty vector에 비해 어느정도 발현이 저해되었는지를 측정함. 그 결과 perfect matched sponge의 경우는 90% 이상, bulged sponge의 경우는 70%이상의 발현이 저해됨을 관찰 함. 이는 세포 안에 있는 target miRNA들이 활발하게 sponge에 결합한다는 것을 의미하는 것으로 제작된 sponge가 잘 작동되고 있음을 확인.

Abstract ▼

The roles of oncogenic miRNAs are widely recognized in multiple types of cancers. Inhibition of single miRNA using antagomiR can efficiently knock-down a specific miRNA. However, the inhibitory effect is transient and often results in subtle phenotype as there are other oncogenic miRNAs contributing

The roles of oncogenic miRNAs are widely recognized in multiple types of cancers. Inhibition of single miRNA using antagomiR can efficiently knock-down a specific miRNA. However, the inhibitory effect is transient and often results in subtle phenotype as there are other oncogenic miRNAs contributing to tumorigenesis in similar fashion.
Here we report a multi-potent miRNA sponges that can inhibit multiple miRNAs simultaneously and stably. As a model system, we targeted miR-21, miR-155 and miR-221/222 that are known as oncogenic miRNAs in multiple tumors such as breast and pancreatic cancers. To achieve efficient knockdown, we tested erfect and bulged matched sponges and introduce multiple miRNA binding sites ranging from one to five. Luciferase reporter assay showed that the multi-potent miRNA sponges efficiently inhibited 4 miRNAs in breast and pancreatic cancer cells. We observed perfect miRNA sponge show better capacity than bulged one, which exhibited a copy number-dependent capacity. Further, we generated a stable,inducible version of the multi-potent miRNA sponge and showed the miRNA sponge can efficiently reduces the level of 4 target miRNAs and correspondingly, ncrease the level of target proteins of these oncogenic miRNAs.
Finally, we showed the induction of miRNA sponge can sensitize cells to cancer drugs and attenuate cell migration activity. Altogether, our study demonstratesthe multi-potent miRNA sponges is a useful tool to examine the effect of simultaneous inhibition of multiple miRNAs.