초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 제 1세부 :버섯 원기형성 관련 단백질 분비서열을 이용한 유용단백질 생산시스템 개발
가. 새송이 버섯 균사체 형질전환법 확립
버섯 생명공학에서의 필수적 요건은 유전자 도입 수단의 확보이다. 유전자 도입을 위한 형질전환 수단으로서 protoplast 방법 (REMI법), biolistic bombardment, electroporation, Agrobacterium 방법 등이 개발되었으나 가장 큰 문제점은 그 효율성 및 재생률이 매우 낮은데 있다. 본 연구에서 균사체 및 자실체 절편을 이용하여

Ⅳ. 연구개발결과
1. 제 1세부 :버섯 원기형성 관련 단백질 분비서열을 이용한 유용단백질 생산시스템 개발
가. 새송이 버섯 균사체 형질전환법 확립
버섯 생명공학에서의 필수적 요건은 유전자 도입 수단의 확보이다. 유전자 도입을 위한 형질전환 수단으로서 protoplast 방법 (REMI법), biolistic bombardment, electroporation, Agrobacterium 방법 등이 개발되었으나 가장 큰 문제점은 그 효율성 및 재생률이 매우 낮은데 있다. 본 연구에서 균사체 및 자실체 절편을 이용하여 protoplast, electroporation, genegun, Agrobacterium 방법 등을 사용하여 형질전환을 시도하였지만, 최적화 조건을 확립하기가 쉽지 않았다. 따라서 시행착오에 의해 Agrobacterium을 이용하여 최적화된 효율로 형질전환체들을 확보하였다.
나. 새송이 버섯 cDNA library제조
새송이 버섯 조직에서 분리한 약 500μg의 totalRNA로부터 oligo(dT)cellulose를 사용하여 Molecularcloning 실험 protocol(Maniatis etal, Cold Spring Harbor, New York)에 따라 poly(A+) cytoplasmic RNA를 추출하였고 λZAP cDNA 합성 kit (Stratagene)를 이용하여 cDNA library (~1x 108 pfu/ul)를 제조하였다. 형성된 재조합 phagelibrary는 원기 분석을 통하여 확인된 단백질들에 대한 유전자 분리를 위한 gene source및 PCR 주형으로 사용하였다.
다. 새송이 버섯 genomicDNA library구성
새송이 버섯 genomic DNA로부터 λFIXII kit (Stratagene)를 이용하여 genomic library(0. 5x106 pfu/ul)를 제조하였다. 형성된 genomicDNA library는 원기로부터 확인된 단백질의 genomicDNA 및 promoter분리, 또는 필요한 부분을 PCR 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다.
라. 원기형성 분비물 단백질 (laccase)에 대한 유전자 확보 및 염기서열 분석 새송이버섯 원기 내 존재하는 단백질을 SDS-PAGE와 2-D 의해 분석한 다음 주요 단백질 조각들을 CAF-MALDIsequencing에 의해 분석한 결과 부분 서열 (LPANKL IEVSIPGAGAHPFHL HGHTFDIVRVSNSD)을 얻었고 Blastsearch 결과 laccase로 밝혀졌다. 따라서 laccase유전자의 염기서열을 참고로 하여 분비벡터 제조에 필요로 하는 laccasepromoter(330bp)및 laccase신호서열(69bp)을 genomicDNA library를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 laccaseDNA 단편들을 확보하였다.
마. PlantVector를 이용한 secretionvector구성
선행적 분비벡터를 구성하기 위하여 CaMV (CauliflowerMosaicvirus)S35promoter를 갖는 pPEV 벡터에 알려져 있는 신호서열 (pathogenesis-relatedprotein1b, 102bp)을 클로닝하여 pPEVPR1b벡터를 구성하였고, 그 벡터에 humangrowthhormone유전자를 도입하여 재조합벡터를 구성한 다음, 새송이버섯 균사체를 이용하여 여러 형질전환 방법에 의해 도입한 결과 Agrobacterium 법에 의해 형질전환체(Pleurotus ernygii/pPEVpR1bhGH)를 구성하여, 차후 재조합벡터 구성의 positivecontrol로 사용하였고, 발현되는 단백질을 SDS-PAGE 및 westernblot에 의해 확인하였다.
바. Promoter및 분비서열을 포함하는 발현/분비벡터 구성 및 GFP발현 Greenfluorescentprotein (GFP)의 유전자를 reportergene으로 사용하여 promoter의 strength 및 적합한 분비서열 조합을 조사하기 위하여, CaMV 35S promoter(538bp), laccasepromoter(330bp), pR1b(pathogenrelatedprotein)signalsequence(102bp), 및 laccasesignalsequence(69bp)등을 사용하여 6종류의 발현/분비 벡터를 구성하였다 (pCam35S, pCam35SLacS, pCam35SpR1b, pCamLacP, pCamLacPS, pCamLacPpR1b vector). GFP의 세기 및 형질전환 선별의 용이성에 의해 가장 효율적인 vector시스템으로서 laccase promoter와 laccase 신호서열 및 pR1b 신호서열로 구성된 발현벡터(pCamLacP, pCamLacPS, pCamLacPpR1bvector)를 선택하였고, 3종류의 발현/분비벡터에 유용유전자 6종류를 도입하여 새송이버섯 재조합 형질전환체 18종을 구성하였다.
사. pCamLacPS에 도입된 유전자들의 발현 :Laccasepromoter및 Laccase분비서열 발현벡터 pCamLacP에 6종 유전자가 도입되어 구축한 재조합벡터들(pCamLacPCSF, pCamLacPEGF, pCamLacPEPO, pCamLacPhGH, pCamLacPPLSP3, pCamLacPSPB)을 함유하는 형질전환체들의 경우 어떤 클론에서도 단백질이 합성되지 않았다.
분비벡터 pCamLacPS에 6 종 유전자가 도입되어 구축한 재조합벡터들 pCamLacPSCSF, pCamLacPSEGF, pCamLacPSEPO, pCamLacPShGH, pCamLacPSPLSP3, pCamLacPSSPB)을 함유하는 형질전환체들의 경우 EGF, hGH, PLSP3를 함유하는 클론들에서 단백질이 분비는 되지 않았지만 세포내에서 발현되었고 (균사체내 총 수용성단백질 중 약 3-7%), 항원항체 반응에 의해 각각의 단백질을 확인하였다.
아. pCamLacPpR1b에 도입된 유전자들의 발현 :Laccasepromoter및 pR1b분비서열 분비벡터 pCamLacPpR1b에 6 종 유전자가 도입되어 구축한 재조합벡터들 pCamLacPpR1bCSF, pCamLacPpR1bEGF, pCamLacPpR1bEPO, pCamLacPpR1bhGH, pCamLacPpR1bPLSP3, pCamLacPpR1bSPB)을 함유하는 형질전환체들의 경우 EGF, hGH를 함유하는 클론들에서 단백질이 분비는 되지 않았지만 세포내에서 발현되었고 (균사체내 총 수용성단백질 중 약 3-5%), 항원항체 반응에 의해 각각의 단백질을 확인하였다.
자. 대량배양에 의한 단백질 발현 패턴 변화
단백질 발현이 확인된 클론들, pCamLacPSEGF, pCamLacPShGH, pCamLacPSPLSP3 pCamLacPpR1bEGF, pCamLacPpR1bhGH을 함유하는 새송이버섯에서 배양시간에 따른 발현 패턴, wetanddryweight, 발현정도 등을 조사하기 위하여 20L 배양기 (working vol. 10L)에서 발효를 진행하였다. 그 결과 pCamLacPShGH 함유하는 형질전환체는 8일 만에 최대성장에 도달하였고, 균사체의 중량(wetweight)은 38g, 건조중량은 2. 3g 이었다. 단백질 발현은 배양시간에 비례하여 증가하였고 분석결과 총 수용성단백질의 15% (24ug hGH/g powder)정도 발현이 되었으며 도입된 유전자도 안정적으로 존재하였다. pCamLacPSEGF 함유하는 형질전환체는 14일 만에 최대성장에 도달하였고 균사체의 중량(wetweight)은 45. 7g, 건조중량은 2. 9g 이었다. 단백질 발현은 배양시간에 비례하여 증가하였고, 분석결과 총 수용성단백질의 5% 정도 발현이 되었으며 도입된 유전자도 안정적으로 존재하였다. pCamLacPSPLSP 함유하는 형질전환체는 14일 만에 최대성장에 도달하였고 균사체의 중량(wetweight)은 35. 5g, 건조중량은 2. 4g이었다. 단백질 발현은 배양시간에 비례하여 증가하였고, 분석결과 총 수용성단백질의 5% 정도 발현이 되었으며 도입된 유전자도 안정적으로 존재하였다. pCamLacPpR1bEGF와 pCamLacPpR1bhGH를 함유하는 형질전환체의 경우에도 5-6%정도의 발현정도를 보였으나, pCamLacPS에 도입된 클론들 (pCamLacPSEGF, pCamLacPShGH)보다는 낮은 수준으로 단백질을 생산하였다.
자. hGH 유전자가 도입된 형질전환체들의 외형적 변화
hGH가 도입된 새송이버섯 균사체와 대조구 새송이버섯 균사체의 성장속도를 비교한 결과 hGH 유전자가 도입된 재조합 균사체 (pCamLacPShGH, pCamLacPpR1bhGH)의 경우 성장속도가 대조구 균사체 보다 대략 ６배 정도 빠른 것으로 나타났다. 이런 결과는 동물유래의 성장호르몬이 식물에서도 작용할 수 있다는 것으로 보여주며, 또한 균사체내에서 생물학적 활성을 갖는 단백질이 합성될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나 균사체에서 자실체를 유도하였을 때는 정상적인 자실체와는 다른 분재형태의 자실체가 형성되는 것으로 확인하였다. 이는 hGH가 균사체의 영양성장에 있어서 성장률 증가에는 좋은 효과를 나타내지만, 자실체로의 생식생장은 저해하는 것으로 보여진다.
차. 형질전환 자실체 분석 :genomicDNA analysis
균사체로부터 유도된 각각의 새송이 버섯 자실체내에 존재하는 유전자를 확인하기 위하여 각각의 자실체로부터 genomicDNA를 추출하였고, 각 유전자에 특이적 primer를 이용하여 PCR 한 결과 targetgene(CSF, EGF, EPO, hGH, PLSP3, SPB)들의 예상된 DNA 조각들이 증폭되었고 최종적으로는 염기서열 분석에 의해 integration여부를 하였다. 또한 자실체로부터 후대검정을 위하여 포자 분리 후 균사체 계대배양을 하여 자실체를 재유도 했을 경우에도 새송이버섯 자실체에 각각의 유전자들이 안정하게 존재하는 것으로 확인하였다 (제 2세대 line구축).
카. 형질전환 자실체들의 전사수준 분석
형질전환된 새송이버섯 자실체에 도입된 유용 유전자의 전사 수준을 조사하기 위하여, 우선 각각의 자실체로부터 totalRNA를 추출하고 각 유전자의 특이적 primer를 사용하여 RT-PCR 방법으로 분석한 결과, 형질전환된 균사체의 자실체에서 각각의 유전자들(CSF, EGF, EPO, hGH, PLSP3, SPB)의 예상된 크기의 DNA 조각들이 증폭되었고, 최종적으로는 염기서열 분석에 의해 확인하였다. 이런 결과는 각 유전자가 도입된 모든 새송이버섯 자실체에서 전사수준까지는 정상적으로 RNA가 합성된다는 것을 보여준다.
타. 형질전환 자실체들의 단백질 발현 분석
분비벡터 pCamLacPS에 도입된 3가지 유전자(hGH, PLSP3, EGF)의 재조합 벡터들(pCamLacPSEGF, pCamLacPShGH, pCamLacPSPLSP3)과 pCamLacPpR1b에 도입된 2가지 유전자(hGH, EGF)의 재조합벡터(pCamLacPpR1bEGF, pCamLacPpR1bhGH)들이 도입된 새송이버섯 자실체로부터 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 및 western blot에 의해 확인한 결과, 약 8. 8kD EGF, 23kD hGH, 27kD PLSP3단백질들이 균사체와 동일한 수준으로 자실체에서도 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다. 다른 유전자들이 도입된 자실체에서는 전사수준에서 mRNA는 만들어지지만 단백질은 생성되지 않는 것으로 분석되었다. 이는 각 유전자들의 mRNA 5’-말단에 존재하는 서로 다른 이차구조에 의해 단백질 합성에 중요한 영향을 미치는 것으로 분석되었다.
파. 재조합 벡터내 신호서열과 유용유전자 서열의 mRNA 이차구조 분석
5’-말단 mRNA에 존재하는 특이 이차구조에 의해 단백질 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, Zuker(1989)의 RNA secondary prediction (mFOLD)program에 의해 이차구조를 분석하였다. pCamLacPS에 도입된 유전자들의 경우에는 laccase 신호서열(69 bp)과 각 유전자의 N-말단 20 아미노산 (60 bp)에 해당하는 서열을 분석하였고, pCamLacPpR1b에 도입된 유전자들의 경우에는 pR1B 신호서열 (102bp)과 각 유전자의 N-말단 20아미노산 (60bp)에 해당하는 서열을 분석하였다. 그 결과 전체적인 경향은 발현율이 증가함에 따라 이차구조의 ΔG 값이 +값으로 증가하는 것으로 나타났고, 단백질 발현이 가장 높은 pCamLacPShGH의 경우 mRNA 이차구조 ΔG 값이 – 13. 07 Kcal/mole로 다른 유전자들의 ΔG 값보다 +쪽으로 가장 높았으며, pCamLacPSEGF (–15. 6Kcal/mole), pCamLacPSPLSP3(– 17. 7Kcal/mole)의 경우에도 흡사한 것으로 나타났다. 또한 pCamLacPpR1bhGH과 pCamLacPpR1bEGF의 경우에도 다른 클론들과 비교해 볼 때, + 값으로 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 도입유전자의 5’-말단에 존재하는 이차구조를 제거하는 것이 새송이버섯에서 유용단백질의 발현에 중요한 요소라는 것을 제시하고 있다.
하. Invitro(Insulinomacell)에서 세포 활성 측정
당뇨세포인 RINm5F 세포에서 유용단백질 hGH 및 EGF의 항당뇨효과 및 세포 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 pCamLacPShGH와 pCamLacPSEGF를 함유하는 균사체를 배량 배양하여 metalchelating법에 의해 hGH 및 EGF를 부분정제 하였다. 준비된 시료를 일정농도로 RINm5F 세포에 처리하여 세포성장효과와 streptozotocin에 의해 유발된 전 당뇨 (prediabetes)모델 RINm5F 세포에 처리 후 세포에 미치는 영향을 조사한 결과, hGH 및 EGF는 최대 5∼20%의 세포활성 증가 효과를 보였으며, RINm5F의 항당뇨 활성은 hGH의 처리 농도 5 ng/ml에서 약 12% 당뇨 개선 효과를 보였으며, EGF는 1ng/ml의 농도에서 약 19% 정도 개선되었다. 이런 결과는 hGH와 EGF가 STZ 처리에 의한 1형 당뇨에서 세포독성 및 세포자살에 대한 보호 및 치유 기능을 갖는 후보물질이 될 수 있을 것으로 사료된다.
가. hGH 생물학적 활성 :사료첨가제
(1)쥐 (SD rat)를 이용한 생체 내 (invivo)실험
발현벡터 pCamLacPShGH를 함유하는 새송이 버섯 균사체를 배양하여 2가지 형태의 시료를 제조하였다 (액상 type, p-hGH1& 2;powder형태, Myc1& 2).
생체 내에서 재조합 hGH의 성장효과는 사료 첨가가제로 제조하여 투여함으로서 쥐의 체중 증가, 생화학적 분석 (지질 수준, 칼슘, ALP, BALP, IGF-1, GH, GHRF), 및 뼈 성장에 대하여 조사하였다. 새송이버섯 균사체를 첨가하지 않은 사료 (negativecontrol)에 비해 재조합 새송이버섯 균사체가 첨가된 액상 그룹과 분말 그룹에서 성장률은 약 3∼5% 증가되었고, 총 콜레스테롤 수준은 약 12∼15% 감소되었으며, LDL-콜레스테롤은 16-28% 감소, 총 트라이글리세라이드 수준은 약 15∼18% 감소되었다. ALP (alkaline phosphatase)의 경우에는 대조구에 비해 15-31%까지 증가하였으며, BALP의 경우에는 29. 7-47. 5%까지 크게 증가한 것으로 나타났다. 성장관련 인자들은 시험구에서 대조구에 비해 IGF-1은17-26%정도, ratGH는 28-46% 정도, GHRF는 26-42%로 크게 증가한 것으로 나타났다. 뼈 성장 측정에서 경골 성장판의 경우에도 시험구에서 길이가 대조구보다 약간 증가한 것으로 나타났다. 이런 결과는 pCamLacPShGH 벡터가 도입된 새송이 버섯 균사체가 생물학적 활성을 가진 hGH를 생산할 수 있다는 것을 보여주며, 재조합 hGH는 쥐의 성장을 촉진시키는데 효과적인 것으로 나타났다.
(2)육계농장에서 필드시험
새송이 버섯 (pCamLacPShGH 함유) 대량배양에 의해 얻은 균사체에서 metal chelating 방법에 의해 단백질을 회수하여 단백질을 정량한 결과 균사체 그람당 약 600ug 정도의 hGH를 얻었다. 말분 (wheatflour)을 이용하여 말분 그람당 hGH 농도가 1ug 되도록 사료첨가제를 제조하였고, 본사료에 0. 1% 정도로 투여하였다. 경북 김천에 위치한 육계농장에서 대조구 (10, 800수)및 시험구 (23, 500수)에 한달동안 투여한 결과, 출고시 전체중량은 시험구는 36, 363kg (대조구 15, 280kg)이었고, 평균 한수당 체중은 시험구는 1. 59kg으로 대조구 1. 45kg보다 9. 6% 정도 증체 효과를 나타냈다. 일당 체중 증가율은 시험구에서 54. 82g이며 대조구의 경우 42. 64g으로 일당증가율이 28. 6% 정도 시험구에서 높게 나타났다. 전체적인 사료요구율 (FE = totalfeed intake/totalbody weight)은 시험구에서 1. 56이었으며, 대조구의 경우 1. 77로서 시험구에서 훨씬 좋은 효과를 보이는 것으로 보여진다. 또한 생산지수의 경우 시험구에서는 341. 95이며, 대조구에서는 235. 16으로 사료첨가제(hGH 포함)를 본 사료에 0. 1% 투여한 결과 생산성이 크게 증가한 것으로 나타났다. 그 결과 대조구에서 사육기간도 5일정도 앞 당겨졌고, 사료비 절감 및 부수적인 농가 소득도 증가한 것으로 나타났다.
나. 상피성장인자(epidermalgrowthfactors, EGF):화장품 원료
EGF (pCamLacPSEGF)단백질의 화장품 안정성 측정 :PH, 점도변화, 온도, 자외선에 안정도가 있는 것으로 확인하였음. Patchtest를 통한 안전성 실험 :개발된 원료나 제품을 이용할 때 피부염이 일어나지 않는 것을 확인하기 위해서 간편한 예비 실험으로서 안전성 확인
다. PLSP3:Semi-quantitativeEnzymeAssay
단백질 분해효소 분비능을 간접적으로 알아보기 위하여 protease assay plate (1% skim milk, 0. 1% yeastextract, 1. 5% agar)에 살균된 paperdisc를 올려놓고 추출한 PLSP3단백질을 점적하여 37℃에서 overnight배양하여 형성된 clearzone을 확인 한결과, protease활성을 갖는 형태로 PLSP3단백질이 발현되었으며 혈전용해제로서 산업적 활용 가능성을 제시하고 있다.
라. 본 연구에서 구성된 pCamLacPSEGF, pCamLacPShGH, pCamLacPSPLSP3, pCamLacPpR1bEGF, pCamLacPpR1bhGH 재조합벡터가 도입된 새송이버섯 균사체는 생물학적 활성을 갖는 재조합 단백질들 (Human growth hormone, Epidermalgrowth factor, Periserrulaleucophryna serineprotease)을 생산할 수 있다는 것을 보여주며, 재조합 hGH는 성장을 촉진시키는 효과. EGF는 세포활성증가, PLSP3는 혈전용해 등에 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 새송이버섯(Pleurotuseryngii)을 생물학적 활성을 갖는 유용단백질을 대량 생산할 수 있는 공장시스템으로 활용할 수 있으며, 이런 발현 시스템의 확립에 의해 산업적으로 다양한 유용단백질 생산에 적용될 수 있을 것이다.
2. 협동과제 :새송이버섯 형질전환법 개발에 의한 기능성 강화 버섯 품종 개량
가. 전체요약
기능성 새송이 품종개발을 위하여 새송이 균사체의 생장촉진을 위한 배양조건, 효율적인 균사체 형질전환 및 선발, 형질전환 균사체의 자실체 생성 유도를 연구하였다. 생장배지에 spentcoffeeground(SCG)를 첨가 시 생장속도 및 생체중량 증가가 나타났으며 flavonoid및 phenol함량 그리고 항산화능이 증가하였다. 기타 죽엽이나 겨우살이 첨가도 SCG와 유사한 효과를 보였다. 당근추출액은 감자추출액을 대신하여 균사체 생장을 증대시키는 효과를 보였다. Metalion은 자실체 발생 개체 수에서의 변화를 일부 야기하였다. 균사체의 형질전환을 위한 Agrobacterium의 이용 시 균사체에 간단한 물리적 상해를 가하는 경우에서만 형질전환이 가능하였다. 색소발현 새송이 제조를 위하여 myb, crtO, PAC (psy+crtl)등의 색소 생합성 관련 유전자를 발현벡터에 도입하였으며 Agrobacterium을 이용하여 균사체 형질전환체를 제조, 선발 및 확인하고 자실체 생산을 유도하였다. 자실체는 대부분 비정상적 형태를 보였으며 삽입변이에 의한 생장저해가 나타났다. 색소형성은 이루어지지 않았는데 새송이의 색소발현시스템에 대한 보다 세밀한 기초 연구가 필요시 되었다. 식용백신용 새송이 제조를 위하여 hepatitis B virus surfaceantigen (HBsAg)및 glutamicacid decarboxylase(GAD1)유전자를 균사체에 도입 후 선발된 형질전환체를 mice에 경구 투여 시 간염 항체형성 및 혈당감소를 확인함으로써 형질전환 새송이의 식용백신으로서의 가능성을 확인하였다.
(1)균사체 생장촉진
커피는 다양한 생리활성물질을 포함하며 커피박 (spentcoffeeground:SCG)에도 상당량 잔존한다. SCG를 1-7. 5% 첨가 시 새송이를 포함한 여러 다른 종류의 균사체에서 생장 촉진 효과가 나타났다. 고체, 액체 또는 병배양에서 생장 직경, 생체 중량 증가 효과가 확인되었으며 flavonoid나 phenol성분의 증가 및 DPPH 소거능 증가도 나타났다.
천연산물인 죽엽이나 겨우살이등도 0. 1–2% 첨가 시 SCG와 유사한 효과를 나타냈다.
감자 추출액을 대신한 당근 추출액을 배지에 첨가 시 새송이, 느타리, 맛느타리, 표고, 잎새 등의 균사체 생장이 훨씬 촉진되었으며 자실체 생산 시 단백질과 fiber함량이 증가하는 것으로 나타났다.
(2)색소발현 새송이
포도의 transcription factormyb, β-carotene을 canthaxanthin으로 전환시키는 기능을 지닌 Haematococcuspluvialisβ-C-4Oxygenase(crtO), carotenoid생합성관련 고추의 phytoenesynthase(psy)및 Pantoea의 caroten desaturase(crtl)을 지니는 PAC gene을 cloning 및 재조합을 통하여 발현벡터에 도입하였다. 이는 Agrobacterium을 이용하여 균사체에 도입하고 hygromycin저항성 선발을 실시하여 형질전환체를 생산하였으며 유전자도입을 PCR, southern blot등으로 확인하였다. 자실체 생산을 유도하였으며 그 결과 형태적으로는 대조군에 비해 대부분 왜소하였으며 T-DNA 삽입변이에 의한 결과로 추축되었다. 색소발현 정도도 대조군과 다르지 않았으며 새송이 색소발현체계에 대한 연구 및 이해가 필요 시 되었다. 한편, 각 형질전환 균사체별로 액체배양을 실시 후 수확한 EPS가 SKOV-3 (ovarian cancer cellline)의 세포활성에 미치는 효과를 MTT법에 의하여 분석하였으며 대조군에 비해 차이가 없거나 촉진시키거나 또는 억제하는 경우로 구분됨으로써 기능성 증대 균사체의 제조를 확인할 수 있었다.
(3)새송이 식용백신
간염바이러스(Hepatitis B virus:HBV)에 대한 식용 vaccine을 제조하기 위하여 HBsAg 유전자를 클로닝하고 발현벡터에 도입하여 pCamHBsAg를 제조하였다.
Agrobacterium을 이용한 형질전환 및 선발 그리고 PCR 및 hybridization을 통한 유전자도입 그리고 ELISA에 의한 단백질 발현정도를 확인하였다. 형질전환 균사체를 BALB/c mice에 경구투여를 실시하고 안와 채혈과 심장채혈을 통하여 간염항체 형성수준을 측정한 결과 prime+oral/booster+oral처리에 의하여 간염항체 생성에 관한 면역반응을 효과적으로 증폭시킴을 알 수 있었다. 경구 투여만으로써 면역원성이 발휘되기 힘들지만 상용백신을 이용한 경우 HBsAg균사체 기능이 뚜렷한 것을 알 수 있었다.
췌장의 glutamic acid decarboxylase (GAD67)는 인슐린 의존성 당뇨(Insulin-depent daibetesmellitus:IDDM)의 발생과 관련되어 있다. GAD67유전자를 클로닝하고 발현벡터에 도입하여 pCamGAD67을 제조하였다. Agrobacterium을 이용한 형질전환 및 선발 그리고 PCR 및 hybridization을 통한 유전자도입 그리고 ELISA에 의한 단백질 발현정도를 확인하였다. 형질전환 균사체를 NOD mice에 반복적으로 경구 투여함으로써 혈당증가가 상당 억제되었으며 인슐린의존성 1형 당뇨의 예방을 위한 식용백신의 효과를 확인할 수 있었다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results of the Research and Development
1. The 1st detailed project : Development of productive system for higher value-added and useful proteins using target sequence of fruiting body primordium-related proteins in mushroom
A. Establishment of transformation method suitable for mycelium of

Ⅳ. Results of the Research and Development
1. The 1st detailed project : Development of productive system for higher value-added and useful proteins using target sequence of fruiting body primordium-related proteins in mushroom
A. Establishment of transformation method suitable for mycelium of Pleurotus eryngii
The necessary requirement in mushroom BT is to secure method for gene introduction.
Although transformation methods such as protoplast (REMI), biolistic bombardment, electroporetion, and Agrobacterium were developed, the big problem is that there is low effectiveness and regeneration rate. In this study, we performed traditional transformation methods (protoplast, electroporetion, gene gun, and Agrobacterium) to find out new protocol of transformation using mycelium and explants of fruiting body. However, it was not easy to establish optimized condition for transformation. Accordingly, we carried out to obtain transformants using Agrobacterium mediated methods through trial and error.
B. Construction of cDNA library of Pleurotus eryngii
From tissue of Pleurotus eryngii, total RNA was extracted, followed by poly(A+) RNA isolation as described in Molecular Cloning protocol (Green and Sambrook, 2012) using oligo(dT) cellulose, and cDNA library (~ 1 x 108 pfu/ul) was constructed using λZAP cDNA synthesis kit (Stratagene, La Jolla, CA). The library was used as gene source and PCR template to screen some genes encoding proteins confirmed by primordium analysis.
C. Construction of genomic DNA library of Pleurotus eryngii
The genomic library (0.5 x 106 pfu/ul) was constructed from genomic DNA of Pleurotus eryngii using FixII kit (Stratagene, La Jolla, CA). The library was used as gene source and PCR template to screen genomic DNA encoding proteins confirmed by primordium analysis.
D. Isolation of gene encoding protein (laccase) in exudate of primordium and DNA sequencing Primordium proteins of Pleurotus eryngii were analyzed using SDS-PAGE and 2-D, and major proteins were characterized by CAF-MALDI sequencing. As a result, partial sequence (LPANKLIEVSIPGAHPFHL HGHTFDIVRVSNSD) of the protein was characterized and it was turned out to be laccase protein by BLAST search. Through retrieval of other reference for laccase DNA sequence, laccase promoter (330 bp) and signal sequence (69 bp) were obtained to construct secretion vector by PCR using genomic DNA library as template.
E. Construction of secretion vector using plant vector
Preceding to main experiment, the pPEVpR1b vector was constructed using pPEV binary vector (Clontech, USA) containing CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) S35 promoter and signal sequence (102 bp) of pathogenesis-related protein 1b. And then the gene of human growth hormone was cloned to the pPEVpR1b vector, named pPEVpR1bhGH, and transferred into mycelium of Pleurotus eryngii using Agrobacterium-mediated transformation.
Finally, transformant harboring the pPEVpR1bhGH was constructed and the expressed protein was analyzed by PAGE and western blot. The clone was used as positive control when next recombinant vectors is constructed because its fast growth appear to be an indicator of efficient transformation.
F. Construction of expression/secretion vector with laccase promoter and signal sequence and GFP expression
To investigate promoter strength and efficient signal sequence by using GFP gene as reporter, 6 types of expression/secretion vectors (pCam35S, pCam35SLacS, pCam35SpR1b, pCamLacP, pCamLacPS, pCamLacPpR1b vectors) were constructed with CaMV 35S promoter (538 bp), laccase promoter (330 bp), pR1b (pathogen-related protein 1b) signal sequence (102 bp), and laccase signal sequence (69 bp). Finally, as efficient vector system by comparison of GFP strength and easiness of transformant selection, expression/secretion vectors composed of laccase promoter, laccase signal sequence, pR1b signal sequence were optimal for our purpose (pCamLacP, pCamLacPS, pCamLacPpR1b vector). By introduction of 6 types useful genes (CSF, EGF, EPO, hGH, PLSP, SPB) into the above expression/secretion vectors, respectively, 16 types of recombinant Pleurotus eryngii were obtained
G. Gene expression cloned in pCamLacPS vector : laccase promoter and signal sequence
There were no expression in pCamLacPCSF, pCamLacPEGF, pCamLacPEPO, pCamLacPhGH, pCamLacPPLSP3, and pCamLacPSPB constructed by cloning 6 types of useful genes into pCamLacP vector. Among recombinant vectors as pCamLacPSCSF, pCamLacPSEGF, pCamLacPSEPO, pCamLacPShGH, pCamLacPSPLSP3, and pCamLacPSSPB constructed by cloning 6 types of useful genes into pCamLacPS vector, each protein (EGF, hGH, PLSP) in pCamLacPSEGF, pCamLacPShGH, and pCamLacPSPLSP3 was not secreted but expressed in mycelium of Pleurotus eryngii (approximately 3-7% of total soluble proteins). The proteins were confirmed by antigen-antibody reaction, respectively.
H. Gene expression cloned in pCamLacPpR1b vector : laccase promoter and pR1b signal sequence
Among recombinant vectors as pCamLacPpR1bCSF, pCamLacPpR1bEGF, pCamLacPpR1bEPO, pCamLacPpR1bhGH, pCamLacPpR1bPLSP3, pCamLacPpR1bSPB constructed by cloning 6 types of useful genes into pCamLacPpR1b vector, each protein (EGF and hGH) in pCamLacPpR1bEGF and pCamLacPpR1bhGH was not secreted but expressed in mycelium of Pleurotus eryngii (approximately 3-5% of total soluble proteins). The proteins were confirmed by antigen-antibody reaction, respectively.
I. Changes of protein expression pattern by large culture
To study changes of expression pattern, mycelium weights (wet and dry), and expression levels under different culturing times, fermentation was carried out using 20 L fermenter (10 L of working volume). As a result, transformant harboring pCamLacPShGH reached to maximal growth at 8 days. When the mycelium was harvested, wet and dry weight were 38 g and 2.3 g, respectively. The protein expression was increased in proportional to culture time and the expression level was 15% of total soluble proteins (~24 ug/g wet powder).
And also, the cloned gene (hGH) was stably maintained in transformant harboring pCamLacPShGH. Transformant harboring pCamLacPSEGF reached to maximal growth at 14 days. When the mycelium was harvested, wet and dry weight were 45.7 g and 2.9 g, respectively. The protein expression was increased in proportional to culture time and the expression level was 5% of total soluble proteins. And also, the cloned gene (EGF) was stably maintained in transformant harboring pCamLacPSEGF. Transformant harboring pCamLacPSPLSP reached to maximal growth at 14 days. When the mycelium was harvested, wet and dry weight were 35.5 g and 2.4 g, respectively. The protein expression was increased in proportional to culture time and the expression level was 5% of total soluble proteins. And also, the cloned gene (PLSP3) was stably maintained in transformant harboring pCamLacPSPLSP. The clones in pCamLacPS vector showed slightly higher expression than those of pCamLacPpR1b vector.
J. Phenotypic change of transformant harboring hGH gene
When the growth rates between control Pleurotus eryngii and recombinant Pleurotus eryngii harboring pCamLacPShGH and pCamLacPpR1bhGH were compared, the recombinant Pleurotus eryngii harboring hGH gene showed 6 times faster growth than that of the control, interestingly. This result indicates that growth hormone originated from animal can influence the activity on plant or mushroom and active protein can be synthesized in the mycelium. However, when the fruiting body was induced by mycelium scratching, it showed bonsai type of Pleurotus eryngii, suggesting that the hGH can affect profitably on the increase of mycelium nutritional growth, while can give bad effect on sexual growth to fruiting body.
K. Fruiting body analysis of transformants : Genomic DNA analysis
To confirm the interest genes in various fruiting bodys, genomic DNAs were extracted from the body. Using gene-specific primer, the expected DNA fragments were amplified for target genes by PCR and finally the correct sequences of the integrated genes were confirmed by DNA sequencing. To verify next generation of the fruiting body, the spores were isolated from each type of fruiting body, followed by serial culture of the mycelium, and the fruting body was re-induced. It was finally confirmed that all fruiting bodies contained stably 6 types of the genes, respectively.
L. Transcriptional analysis of the integrated genes in the transformants
To investigate transcriptional levels of the cloned genes in fruiting bodies of recombinant Pleurotus eryngii, total RNAs were extracted from the fruiting bodies. Using gene-specific and oligo(dT) primers, the expected DNA fragments were amplified for target RNAs by RT-PCR and finally the correct sequences of the amplified fragments were confirmed by DNA sequencing, indicating that all fruiting bodies can normally make gene-specific RNA.
M. Translational analysis of transformants : Protein analysis
From fruiting bodies of various transformants (pCamLacPSEGF, pCamLacPShGH, pCamLacPSPLSP3, pCamLacPpR1bEGF, and pCamLacPpR1bhGH), the proteins were extracted and analyzed in SDS-PAGE and western blot. As a result, the specific protein bands (8.8 kD EGF, 23 kD hGH, and 27 kD PLSP) were confirmed, showing that the fruiting bodies expressed same specific proteins as in the mycelium. The fruiting bodies containing other genes can make RNA at transcriptional level, but the proteins were not synthesized, indicating that mRNA secondary structure present in 5’-end of mRNA might affect importantly on the synthesis of proteins.
N. Prediction of mRNA secondary structure present in signal sequence and 5’-end of genes To study effect of mRNA secondary structure on protein synthesis, it is analyzed using mFOLD program (Zuker, 1989). In case of the genes cloned in pCamLacPS vector, laccase signal sequence (69 bp) and DNA sequence (60 bp) in 5’-end of genes were analyzed, while pR1b signal sequence (102 bp) and DNA sequence (60 bp) in 5’-end of genes were analyzed for the genes cloned in pCamLacPpR1b vector. The overall expression trends were proportional to the increase of ΔG value to + direction as expression level is increased. In case of pCamLacPShGH showing high level expression of hGH, ΔG value was predicted to be –13.07 Kcal/mole, which is higher value (to + direction) than those of other clones.
The pCamLacPSEGF (- 15.6 Kcal/mole) and pCamLacPSPLSP3 (- 17.7 Kcal/mole) which expressed EGF and PLSP proteins showed similar trend as in pCamLacPShGH. In pCamLacPpR1bhGH and pCamLacPpR1bEGF, ΔG values were increased to + direction, compared with other clones. Accordingly, it is assumed that disruption of mRNA secondary structure present in 5’-end of gene might be important factor for gene expression in Pleurotus eryngii.
O. Measurement of cell viability in insulinoma cell (RINm5F)
To investigate antidiabetic effect and cell viability of insulinoma RINm5F cell by hGH and EGF, the samples were prepared by large culture of transformants harboring pCamLacPShGH and pCamLacPSEGF, followed by partially purification using metal chelating method and treated in culture broth of RINm5F cell and STZ-treated RINm5F cell to examine the effects. As a result, hGH and EGF increased cell viability to 5-20% and antidiabetic effects were improved to 12% (hGH, at 5 ng/ml conc.) and 19% (EGF, at 1 ng/ml conc.), suggesting that by treatment of hGH and EGF in typeI diabetes (STZ-treated cell), these materials can be candidates having protective and curing functions for cell toxicity and cell death.
P. Biological activity of hGH : feed additive
(1) In vivo experiment of SD (Sprague Dawley) rat
Two types of feed additives (liquid and powder) were manufactured by mycelial culturing of transformant harboring pCamLacPShGH (liquid type, p-hGH1 & 2 ; powder type, Myc1 & 2). The effects of mycelial extracts containing hGH on growth rate, plasma lipid levels, alakaline phosphatase (ALP, BALP) activity, growth related factors (GH, IGF-1, GHRF) and bone growth were investigated after 4 weeks of treatment. The growth rates of the treated groups slightly increased approximately 3-5%, compared to that of the control group, but it was not a dose-dependent effect and total cholesterol levels of the treated group decreased by approximately 12-15% ; LDL-cholesterol levels (16-28% decrease), and total triglyceride level (15-18% decrease), compared to the control group. The levels of ALP and BALP increased largely to 15-31% and 29.7-47.5%, respectively, compared to the control group.
And also, levels of growth-related factors increased largely to 17-26% of IGF-1, 28-46% of rat GH, and 26-42% of GHRF, respectively. In experiment of bone growth, tibial growth plate increased slightly than the control group and serum BALP is considered to be a good marker of bone formation. Conclusively, these results indicate that hGH expressed in mushroom was biologically active and stimulated effectively rat growth.
(2) Field test in chicken broiler farm
From large mycelial culture of transformant harboring pCamLacPShGH, the mycelium was harvested and lyzed. The hGH was partially purified by metal cheating method and the concentration was determined to be approximately 600 ug/g of wet weight. Feed additive was manufactured by mixing the hGH and wheat flour (1 ug hGH/g powder of wheat flour) and administrated with a final concentration of 0.1% to main feed during 1 month.
Field test was carried out in chicken broiler farm located in Kimcheon (Gyeongbuk). Chicks were randomly divided into two groups, control group (10,800 chicks) and treated group (23,500 chicks). Before going to the market, total body weights (TBW) were weighed (treated group, 36,363 kg ; control group, 15,280 kg). Average body weight (ABW) of treated group is 1.59 kg, while that of control group is 1.45 kg. There was 9.6% of weight gain effect in the treated group. Average daily gain (ADG) is 28.6% higher in the treated group (54.82 g) than that of the control group (42.64 g). Feed efficiency (total feed intake/total body weight) showed better effect in the treated group (1.56) than the control group (1.77). And also, production index (PI) was largely increased in the treated group (341.95) than that of the control group (235.16), indicating that addition of hGH (0.1%) can stimulate all growth related factors. Accordingly, culturing period will be shortened (4-5 advanced days to market), feed cost will be saved and farm income will increase by treatment of new functional feed additive.
Q. Epidermal growth factor (EGF) : cosmetic ingredient
Measurement of cosmetic stability by EGF : it was confirmed that there were stabilities for pH, viscosity, temperature, and UV
Safety experiment by patch test : it was confirmed that EGF did not give rise to dermatitis R. Periserrula leucophyryna serine protease (PLSP3) : Semi-quantitative assay To test protease activity of PLSP3 expressed in mycelium of Pleurotus eryngii, partial purified PLSP was spotted on sterilized paper disc in protease assay plate (1% skim milk, 0.1% yeast extract, 1.5% agar) and incubated at 37℃ overnight. As a result, clear zone was observed around paper disc, suggesting that PLSP was expressed as biological active protein in the mycelium and it present industrial utilization of PLSP as fibrinolytic protease.
S. In this study, we are presenting that biological active proteins can be produced in recombinant Pleurotus eryngii harboring various vectors, hGH with growth-stimulating effect, EGF with cell viability promotion, and PLSP with fibrinolytic activity. Accordingly, we can utilize Pleurotus eryngii to produce biological active proteins as factorial system, and this expression system will be applicable for production of industrially useful, other proteins.
2. The 1st cooperative project : Breeding of new mushroom species enriched with biological functionality
A. Total summary
In order to develop a high-valued Pleurotus eryngii cultivar, improvement of mycelium culture condition, methods of practical transformation and selection, and induction of fruiting body have been investigated. Supplementation of spent coffee ground (SCG) to the culture media resulted in the increase of mycelium growth rate and biomass and enhancement of flavonoid and phenol contents and antioxidative activity. Similar results were observed by the supplementation of bamboo leaf and mistletoe extracts. Carrot extracts, instead of potato extracts in the culture medium, greatly increased the mycelium growth rate. Addition of metal ion during bottle culture resulted in the slightly different number of fruiting body generation. In order to establish an efficient transformation method using Agrobacterium, a brief mechanical wounding to the mycelia was determined to be prerequisite before co-cultivation with the bacteria.
In order to produce pigmented P. eryngii, pigment-biosynthesis related genes including myb, crtO and PAC (psy+crtl) were cloned and introduced into the mycelium to finally obtain transgenic fruiting bodies. In most cases, transgenic P. eryngii was retarded in its growth and deformed. No distinctive change in pigment development in the transgenic mushroom suggested a further study of pigment biosynthesis system in P. eryngii in the future.
P. eryngii mycelium was exploited as edible vaccines against hepatitis B virus and type I diabetes. Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and glutamic acid decarboxylase (GAD1) were cloned, constructed as expression vectors, and introduced into the mycelium.
Oral administration of transgenic mycelia expressing HBsAg and GAD1 in mice resulted in the significant induction of anti-HBsAg antibody in BALB/c mice and the suppression of blood glucose level in NOD mice, respectively.
B. Detailed summary
(1) Acceleration of mycelium growth
Many bioactive compounds are still remained in spent coffee grounds (SCG), a coffee waste. Supplementation of 1-7.5% SCG to the culture medium accelerated the mycelium growth of P. eryngii and also other several mushroom species. In solid, liquid and bottle cultivation, SCG was greatly effective for the improvement of growth and biomass, total contents of flavonid and phenol, and DPPH scavenging activity. The effect of 0.1-2% bamboo leaf or mistletoe extracts was very similar to that of SCG. Carrot extracts were found to be an excellent substitute for potato extracts in the cultivation medium to accelerate the mycelium growth of P. eryngii, P. ostreatus, Lentiniula edodes and Grifola frondosa. Also, improvement of total protein and fiber contents was made by carrot extract-based cultivation.
(2) Pigment biosynthesis in transgenic P. eryngii
Transcription factor myb from grape, Haematococcus pluvialis β-C-4 oxygenase (crtO) that converts β-carotene to canthaxanthin, and carotenoid-biosynthetic PAC containing pepper phytoene synthase (psy) and Pantoea caroten desaturase (crtl) were cloned and introduced into the expression vector. Mycelia transformants generated by Agrobacterium-mediated method were confirmed by PCR and dot blot hybridization. Almost all of the transgenic fruiting bodies showed smaller than the wild type in size, implying the results of T-DNA insertion-mediated genetic mutagenesis. No change in the level of pigmentation was monitored suggesting a further study to be needed for detailed understanding of the metabolic system of pigment biosynthesis in P. eryngii. Extracellular polysaccharides from some of the mycelia transformants showed a significant toxicity to SKOV-3 (ovarian cancer cell line) in MTT assay. This indicated improvement of EPS function owing to T-DNA insertional mutagenesis in P. eryngii.
(3) Evaluation of transgenic P. eryngii as an edible vaccine
In order to generate edible vaccine against hepatitis B virus, hepatitis B surface antigen (HBsAg) was cloned and inserted into expression vector to obtain pCamHBsAg. Mycelium was transformed by the Agrobacterium method and selected by hygromycin resistance.
Transgene integration was verified by PCR and dot blot hybridization. HBsAg protein expression was measured by ELISA. Oral administration of the mycelium expressing HBsAg in mice significantly increased anti-HBsAg antibody titer levels using a double prime-boost strategy that combined parenteral and oral HBsAg boosters. It was evident that parenteral priming led to a recall response induced by mycelium-derived HBsAg. Transgenic mycelium was verified as an excellent immuno-booster effector in combination with a primer and booster injection of the commercial vaccine.
Pancreatic glutamic acid decarboxylase (GAD67) is strongly associated with insulin-dependent diabetes mellitus. GAD67 was cloned and introduced into the expression vector to construct pCamGAD67. Mycelium was transformed by the Agrobacterium method and selected by hygromycin resistance. Transgene integration was verified by PCR and dot blot hybridization. GAD67 protein expression was confirmed by western blot and ELISA.
Notably, oral administration of the GAD67 mycelium to prediabetic NOD mice kept the initial blood glucose levels almost constant for 15 weeks, and sufficiently prevented the onset of diabetes. Optimized oral delivery of the mycelia expressing higher levels of GAD67 antigen could eventually provide a convenient way to prevent type I diabetes.

목차 Contents

• 표지 ... 1제 출 문 ... 2요 약 문 ... 3SUMMARY ... 17CONTENTS ... 31목차 ... 50제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 68 제 1 절 연구개발의 목표 ... 68 1. 연구개발의 최종목표 ... 68 2. 연구개발의 성격 및 현황 ... 68 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 78 1. 연구개발 목적 ... 78 2. 연구개발 필요성 ... 80제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 84 제 1 절 국외 기술개발 현황 ... 84 1. 국외 버섯 연구동향 ... 84 2. 국외 GM 작물현황 ... 87 3. 국외 바이오시밀러 동향 ... 90 4. 국외 기능성 건강식품 동향 ... 97 제 2 절 국내 기술개발 현황 ... 100 1. 국내 버섯 연구동향 ... 100 2. 국내 GM 작물현황 ... 103 3. 국내 바이오시밀러 동향 ... 104 4. 국내 기능성 건강식품 동향 ... 111제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 113 제 1 절 제 1세부 : 버섯 원기형성 관련 단백질 분비서열을 이용한 유용단백질 생산 시스템 개발 ... 113 1. 연구개발수행 내용 및 방법 ... 113 2. 연구결과 ... 122 제 2 절 협동과제 : 새송이버섯 형질전환법 개발에 의한 기능성 강화 버섯 품종 개량 ... 385 1. 연구개발 수행 내용 및 방법 ... 385 2. 연구결과 ... 388 제 3 절 생물학적 활성 ... 472 1. Invitro에서 세포 활성 ... 473 2. 성장호르몬 (human growth hormone) ... 476 3. 상피성장인자(epidermal growth factors, EGF) ... 484 4. 혈전용해제 (Fibrinolytic protease, PLSP3) ... 490제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 492 제 1 절 총괄 연구개발 목표 달성도 ... 492 1. 총괄연구목표 및 달성도 ... 492 제 2 절 연도별 연구개발 목표 달성도 및 관련분야 기여도 ... 493 1. 제 1세부 : 버섯 원기형성 관련 단백질 분비서열을 이용한 유용단백질 생산시스템 개발 ... 493 2. 제 2 세부 협동 : 새송이버섯 형질전환법 개발에 의한 기능성 강화 버섯 품종 개량 ... 496 3. 평가의 착안점 및 기준 ... 499제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 501 제 1 절 연구개발 성과 ... 501 1. 연구논문 및 학술대회 발표 ... 501 2. 특허 등록 및 출원 ... 506 제 2 절 연구성과 활용 계획 ... 518 1. 기술이전 ... 518 2. 기술이전에 의한 상품개발 ... 519 3. 개발기술 활용계획 및 판매 전략 ... 520 4. 타 연구 활용계획 ... 521제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 522제 7 장 연구시설 장비 현황 ... 523제 8 장 참고문헌 ... 524끝페이지 ... 534