보고서 정보
주관연구기관 |
전남대학교 Chonnam National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2014-12 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201500011214 |
과제고유번호 |
1545007079 |
사업명 |
생명산업기술개발 |
DB 구축일자 |
2015-07-18
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500011214 |
초록
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[세부과제]
Ⅰ. 제 목 : 천연 항생 펩타이드 발굴 및 산업적 적용
Ⅳ. 연구개발결과
□ 본 연구에서는 고추잎으로부터 식물내생세균을 분리하여 항균활성을 보이는 균주를 다수 확보하여 EML-culture collection에 glycerol stock으로 deep freezer에 보존하였음.
□ 이 중 항생 펩타이드 생성 균주로서 Bacillus 속 균인 EML-CAP3 및 EML-CAP7 균주를 선발하여 본 실험에 이용하였음.
□ 선발된 EML-CAP3 및 EML-CAP7 균주를 16S rRNA를
[세부과제]
Ⅰ. 제 목 : 천연 항생 펩타이드 발굴 및 산업적 적용
Ⅳ. 연구개발결과
□ 본 연구에서는 고추잎으로부터 식물내생세균을 분리하여 항균활성을 보이는 균주를 다수 확보하여 EML-culture collection에 glycerol stock으로 deep freezer에 보존하였음.
□ 이 중 항생 펩타이드 생성 균주로서 Bacillus 속 균인 EML-CAP3 및 EML-CAP7 균주를 선발하여 본 실험에 이용하였음.
□ 선발된 EML-CAP3 및 EML-CAP7 균주를 16S rRNA를 분석하여 동정한 결과, 각각 B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus로 동정되었음.
□ 최적배양조건을 조사한 결과, EML-CAP3 균주의 경우, YMB 배지, 30 또는 35℃, pH7의 조건에서 탄소원으로 soluble starch, 질소원으로 malt extract 첨가시에 최적의 생장을 보였고, EML-CAP7 균주의 경우, YMB 배지, 25 또는 30℃, pH 4-8의 조건에서 탄소원으로 soluble starch, 질소원으로 peptone을 첨가했을 때 양호한 생장을 보였음.
□ 두 균주의 ethyl acetate 및 acetonitrile (ACN)으로 추출한 조추출물에서 곰팡이성 식물병원균에 대한 항균활성을 확인하였으며 in vivo에서도 식물병 방제효과가 높은 것을 확인하였음.
□ EML-CAP7 균주는 60% ACN으로 추출한 조추출물에서 가장 높은 항균활성을 보였으며, 1% LB+1% soluble starch+0.5% peptone 조합 배지 및 pH 8의 조건에서 배양했을 때 펩타이드성 물질의 생성량이 높았으며 항균활성도 높게 나타났음.
□ 분리된 EML-CAP7 균주의 펩타이드성 조추출물을 HPLC 분석한 결과, 총 8개의 peak가 확인되었으며, 각각의 peak 분획물의 Fusarium proliferatum에 대한 포자발아 억제효과를 검정한 결과, peak 1, 2, 3 분획물에서 높은 포자발아 억제효과를 보였음.
□ 상기의 분리된 각각의 peak 분획물을 LC-MS를 이용하여 분자량을 분석한 결과, peak 1은 1057.7, peak 2는 1071.2, peak 3은 1085.8, peak 4는 1036.9, 1085.9, 1449.3, 1481.3, peak 5에서는 1463.4, peak 6는 1477.3, 1491.2, peak 7은 1505.2, peak 8은 1505.2, 1036.9의 분자량을 가진 호합물이 검출되었으며 이는 iturin계와 fengycin계 물질이 주를 이루는 것으로 판단되었으며 으며 일부는 기존의 분자량과 다른 신규 펩타이드로 추정되었음.
□ EML-CAP7 균주를 이용한 제형화 연구를 위해, 밀기울, 쌀겨, 대두박, 오트밀, 옥수수 배지를 주성분으로 배양할 경우 도열병균에 대한 항균활성이 중간의 항균활성을 나타냄을 알 수 있었으며, 특히 밀기울 기질을 기초로 조제된 배지는 다른 주성분에 비해 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였음.
□ EML-CAP3 및 EML-CAP7 균주를 콜로이드 chitin을 넣은 배지에 점적하여 키틴분해활성을 조사한 결과 높은 활성을 보였으며, 흰가루병원균과 Fusarium균의 포자에 대한 억제활성을 확인하였고 외피가 chitin으로 구성된 곤충에 대한 억제활성을 조사한 결과 EML-CAP3 및 CAP7 균주 유래 펩타이드가 각각 200 ppm, 100 ppm에서 80% 수준의 치사율을 보였으며 이는 균에 대한 억제활성 기작도 곰팡이 세포벽의 글루칸이나 키틴에 작용할 것으로 추정되었음.
□ 선발된 항생 펩타이드 생성 균주인 EML-CAP7 및 EML-CAP3 균주의 대량배양 조건 확립, 제형과 기초연구, 병방제기작 연구를 통해 항생 펩타이드 생성균주 및 펩타이드 원천기술을 확보하였으며 균주특허권 확보를 바탕으로 관련 기업체와의 기술실시와 관련된 비밀유지계약서 체결, 기술이전 검토의견서 교환 등 기술실시를 위한 사업화 연구를 추진하였음.
[협동과제]
Ⅰ. 제 목 : 식물내생 미생물로부터 천연 항생 펩타이드 분리 및 기작 연구
Ⅳ. 연구개발결과
□ 항생 펩타이드의 분리 및 활성을 검정하였음.
□ 항생 펩타이드성 추출물의 식물 병원성 미생물에 대한 항균 스펙트럼 및 병방제 활성을 확인하였음.
□ 천연 항균단백질 (펩타이드)을 식물병원성 미생물을 대상으로 작용 메카니즘을 탐색하였음.
□ 아미노산 서열분석을 통해 신규 분리 펩타이드가 기본적으로는 α-helical 구조를 가지고 있음을 확인하였음.
□ 항생 펩타이드의 대량 생산에 대한 조건 확립으로 위 확보된 신규 펩타이드의 합성 방법으로 9-fluorenylmethoxycarbonyl 고상 합성 (F-moc solid phase synthesis) 기술을 확보하였음.
Abstract
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[세부과제]
I . Title : Isolation of natural anti-microbial peptides and industrial application
III. Results
□ In this study, 10 endophytic bacterial candidates showing antifungal activity were isolated from healthy leaf of red pepper, and kept at deep freezer (-80℃) as glycerol stock.
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[세부과제]
I . Title : Isolation of natural anti-microbial peptides and industrial application
III. Results
□ In this study, 10 endophytic bacterial candidates showing antifungal activity were isolated from healthy leaf of red pepper, and kept at deep freezer (-80℃) as glycerol stock.
□ Out of them, two isolates of Bacillus spp. EML-CAP3 and EML-CAP7 were finally selected for main works.
□ Based on 165 rRNA gene sequence analysis, the EML-CAP3 and CAP7 isolates were identified as Bacillus amyloliquefaciens and B. methylotrophicus, respectively.
□ EML-CAP3 and CAP7 strains grew best on YMB medium. CAP3 isolate grew best at 30 to 35°C and pH7, and utilized soluble starch effectively as carbon source and malt extract as nitrogen source while EML-CAP7 isolate grew best at 25 to 30°C in the range of pH 4-8, and effectively utilized soluble starch as carbon source and peptone as nitrogen source.
□ Ethyl acetate extract and ACN extract from culture broth of the two strains showed antifungal activity against several phytopathogens as well as biocontrol effect against plant diseases in vivo.
□ Out of different ACN extraction concentration conditions, 60% ACN exudate from culture broth of EML-CAP7 on SPE column showed the highest peptide recovery and antifungal activity. In addition, the best medium and pH conditions were 1% LB medium containing 1% soluble starch and 0.5% peptone and at pH 8, respectively.
□ Crude peptides from SPE column extraction were analysed using HPLC. In total, 8 peaks were shown. Out of them, peaks 1, 2, and 3 showed high inhibition effect on spore germination of fungi such as Fusarium.
□ Based on LC-MS analysis, each molecular weight represented 1057.7 for peak 1, 1071.2 for peak 2, 1085.8 for peak 3, and 1036.9, 1085.9, 1449.3, 1481.3 for peak 4, 1463.4 for peak 5, 1477.3 and 1491.2 for peak 6, 1505.2 for peak 7, 1505.2 and 1036.9 for peak 8, mainly comprising of iturin and fengycin type peptides.
□ When substrate utilization pattern of EML-CAP7 was tested on solid culture medium using several agricultural by-products such as rice bran, wheat bran, soybean meal, oatmeal and com, wheat bran was the best substrate for the bacterial growth.
□ Antagonistic activities of EML-CAP3 and EML-CAP7 strains were also related to their ability to degradation of chitin. In addition, the crude peptides derived from cultures of EML-CAP3 and EML-CAP7 showed 80% mortality against aphid at 200 and 100 ppm, respectively, showing that the mode of action is due to inhibitory effect on glucan and chitin in fungal cell wall.
□ 50 far, 6 patents in relation to antimicrobial peptide and active strains for plant protection have been submitted or published and 4 patents were registered for licensing and industrialization. Non-disclosure agreement and review report for technical know-how transfer between CNU and related company have been currently exchanged.
[협동과제]
I. Title : Isolation and mode of action of natural antimicrobial peptides from endophytic microorganisms
III. Results
□ Screening of antifungal activity and purification of antimicrobial peptides derived from 14 strains provided by Prof. HB Lee, Environmental Microbiology Lab (EML), Chonnam National University.
□ Screening of antimicrobial activity of extracted proteins and selection of potential candidate, Bacillus amyloliquefaciens EML-CAP3 for additional works.
□ Screening of purified antimicrobial peptides from B. amyloliquefaciens EML-CAP3.
□ Mechanism of natural antimicrobial protein (peptides) derived from Bacillus amyloliquefaciens in human pathogenic microorganisms.
□ Analysis of amino acid sequence from natural antimicrobial protein peptides.
□ Purification of three peptides (PT14-3, PT14-4a and PT14-4b) with broad spectrum of antifungal activity against Fusarium solani and Fusarium oxysporum.
□ The results of the present study suggested that antifungal peptides (PT14-3, PT14-4a and PT14-4b) induced morphological changes in the conidial cells along with swelling of hyphae and spores with no hemolytic or cytotoxic activity in human cell lines at all.
□ Based on tricine gel electrophoresis, the molecular weights of these peptides represented 1 kDa to 3.5 kDa,
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