[보고서]바이오연료 생산을 위한 미세조류의 유전적 변형과 생물학적 엔지니어링

보고서 정보

주관연구기관

한국과학기술원
Korea Advanced Institute of Science and Technology

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2015-05

과제시작연도

2014

주관부처

미래창조과학부
Ministry of Science, ICT and Future Planning

등록번호

TRKO201600000083

과제고유번호

1711015397

사업명

글로벌프론티어사업

DB 구축일자

2016-04-02

키워드

바이오매스.바이오연료/디젤.미세조류의 세포대사/조절시스템.시스템 생물학/생물공학.신호전달.형질전환.대사경로.국가경쟁력.Biomass.Biofuels/diesel.Microalgal cellular metabolism/regulatory system.Systems biology/biotechnology.Signal transduction.Genetic transformation.Metabolic pathways.National competitiveness.

DOI

https://doi.org/10.23000/TRKO201600000083

표 그림 1. Highthroughput 시스템 생물학의 진일보
표 그림 2. 고등식물 및 미세조류에서 예측되는 지질생합성 관련 대사경로 (US DOE.)
표 그림 3. 최근에 개발된 유전자가위 CASPR/Cas9으로 편리하게 유전체교정실시 (Doudna and Charpentier, 2014)
표 그림 4. Flat panel phorobioreactors (Kwon et al., 2012)
표 그림 1. Comparison of lipid content of Wild-Type and Mutant #91 by photoluminescence
표 그림 2. Comparison of growth rate of Wild-Type and Mutant #91
표 그림 3. Comparison of lipid content of Wild-Type and Mutant #91 before and after Nitrogen starvation
표 그림 4. Fluorescence microscope images of Wild-Type and Mutant #91 before and after nitrogen starvation
표 그림 5. 미세조류 내 지질 생합성 경로 (본 연구에서는 GAPDH와 DAGAT 유전자를 선정하였음)
표 그림 6. 재조합된 벡터의 제작 (왼쪽 상단부터 시계방향으로 pCrN1DA, pCrN1G3, pCrC6G3, pCrC6DA)
표 그림 7. PCG 형질전환체 배양 사진 (하이그로마이신이 첨가된 TAP 배지에 형질전환체를 배양한 결과)
표 그림 8. XbaⅠ으로 처리하여 선형화된 삽입 DNA와 primer set
표 그림 9 . PNG 형질전환체의 PCR
표 그림 10. PNG 형질전환체의 최종 균주 선별 실험-흡광도 측정
표 그림 11. PNG 형질전환체의 최종 균주 선별 실험-FAME 분석
표 그림 12. TAP 배지에서 배양한 형질전환체(PNG)의 생장속도 – 흡광도 측정
표 그림 13. TAP 배지에서 배양한 형질전환체(PNG)의 생장속도-건조 질량
표 그림 14. 42시간동안 배양한 야생형과 형질전환체(PNG)의 FACS 분석 결과
표 그림 15. 시간에 따른 암모늄 농도 변화 추이
표 그림 16. 유도 후 야생형과 형질전환체(PNG)의 시간에 따른 흡광도
표 그림 17. 유도 후 야생형과 형질전환체(PNG)의 시간에 따른 건조 질량
표 그림 18. 클로로필 및 카르테노이드 함유량 분석
표 그림 19. FAME 함량 비교
표 그림 20. FAME yield 함량 비교
표 그림 21. TAP에서 48시간 배양한 야생형(좌)과 형질전환체(우), 40배 확대
표 그림 22. 시간, 배지에 따른 세포 분열된 딸세포수 분포도
표 그림 23. N이 없는 조건에서 BODIPY로 염색한 세포의 모습 (콘포칼 현미경, 200배 확대)
표 그림 24. 실시간 PCR을 통한 GAPDH cDNA 발현량 비교
표 그림 25. 장기 배양(16일) 후 흡광도(좌 )와 건조질량(우)
표 그림 26. 장기 배양(16일) 후 FAME 함량(좌) 및 FAME yield(우)
표 그림 27. 장기 배양(16일) 후 탄수화물 함량(좌)과 단백질 함량(우)
표 그림 28. confocal 현미경 (좌)과 TEM(우)를 통한 lipid droplet 관찰
표 그림 29. 음성 주광성을 이용한 실험
표 그림 30. autoflocculation (좌 : 대조군, 우 : 형질전환체(PNG))
표 그림 31. 다양한 방법의 유전자 knock out
표 그림 32. Maa7 유전자를 이용한 auxotrophic selection 방법
표 그림 33. Maa7 유전자의 knock out을 위한 가이드 RNA 디자인
표 그림 34. CRISPR/Cas9에 의한 small indels (10개중 4개)
표 그림35 RESDA PCR 결과. (a) RESDA PCR 모식도. (b) Amp II 결과. (c) NsTShble 시퀀싱 예시
표 그림36 NssfCherry 형질전환체 분석. (a) pNssfCherry 벡터 맵. (b) Shble 콜로니 PCR 전기영동 결과. (c) 18s rDNA 콜로니 PCR 전기영동 결과. (d) sfCherry 형광 단백질 western blot 결과 (e) SDS-PAGE 결과
표 그림37 N. salina 공초점 형광 현미경 이미지
표 그림 38 재사용 배지 (CM)을 이용한 콜로니 배양 결과. (a) CM농도에 따른 콜로니 사이즈 분석. (b) CM 농도에 따른 콜로니 성장 곡선.
표 그림 39 재사용 배지를 이용한 N. salina 형질전환 효율. (a) 5X108 cell을 사용했을 경우 얻은 형질전환체 수. (b) 형질전환체 크기 분석
표 그림 40 형질전환체 콜로니 PCR 결과. (a) 벡터맵. (b) 일반 f/2 고체 배지에서 얻은 형질전환체 콜로니 PCR 결과. (c) 30% CM 이 포함된 고체 배지에서 얻은 형질전환체 콜로니 PCR 결과.
표 그림 41 N. gaditana에서 bHLH 전사인자 발현량
표 그림 42 bHLH2 과발현 벡터 (pNs302) 모식도
표 그림 43 NsbHLH2 형질전환체 flag tag western blotting 결과
표 그림 44 NsbHLH2 후보군 batch screening 테스트 결과
표 그림 45 NsbHLH2 후보군 well plate screening 테스트 결과. (a) Normal condition, (b) Nstarvation, (c) N limitation, (d) Osmotic stress.
표 그림 46 NsbHLH2 형질전환체 Normal condition phenotype assay (a) 성장곡선, (b) DCW, (c) FAME content, (d) FAME yield.
표 그림 47 NsbHLH2 형질전환체 N limitation condition phenotype assay (a) 성장곡선, (b) DCW, (c) FAME content, (d) FAME yield.
표 그림 48 NsbHLH2 형질전환체 osmotic stress condition phenotype assay (a) 성장곡선, (b)
표 그림 49 Shble 유전자에 대한 Southern blot 분석. V, vector; W, wild type
표 그림 50 도입된 bHLH2 qRT-PCR 발현량 분석
표 그림 51 전체 bHLH2 qRT-PCR 발현량 분석
표 그림 52 (좌) 흡광도 0.1에서 콜체미드를 처리하였을 때의 세포 생장곡선 (우) 흡광도 0.7에서 콜체미드를 처리하였을 때의 세포 생장곡선
표 그림 53 18일간의 배양 후 중성지질량을 나일 레드 형광을 통해 측정한 그래프. 측정 결과 대조군에 비해 나일 레드 형광 값이 높은 균주 4개를 골라낼 수 있었다. (CMD ex 1, CMD ex 4, CMD ex 6, CMD st 6)
표 그림 54 반수체 C.reinhardtii와 선별된 네 개의 균주의 DNA 추출결과. 상단의 굵은 선이 지노믹 DNA(genomic DNA)이고 하단의 흐린 선이 리보조말 RNA(ribosomal RNA)이다. CMD ex 1과CMD ex 4가 약 2배의 형광값을 가지는 것을 확인 할 수 있다.
표 그림 55 HELOS 입자 크기 분석기를 이용하여 세포 크기를 분석한 결과.
표 그림 56 세포 흡광도 변화 (왼쪽 위), 세포 밀도 변화 (오른쪽 위), 세포건조질량 (왼쪽 아래), 세포 질량 (오른쪽 아래) 그래프. 세포의 질량은 배양 7일 째에 측정한 세포건조질량을 세포밀도로 나눠서 얻을 수 있었다. 질소원이 있는 배지에서 이배체가 반수체에 비해 세포 분열 속도가 늦고 정체기에 더 낮은 세포밀도로 진입함을 알 수 있었다.
표 그림 57 나일 레드 염색을 통한 중성지방함량 측정 결과. 질소원이 없는 배지에서 이배체인 CMD ex 1과 CMD ex 4의 지질 함량이 반수체인 CC-124에 비해 3배 정도 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
표 그림 58 (좌) 질소원이 있는 배지와 질소원이 없는 배지에서 키운 5개의 균주의 FAME 분석 결과
표 그림 59 Comparison of growth and FAME contents of haploid and diploid under oxidative stress
표 그림 60 Comparison of growth and FAME contents of haploid and diploid under low temperature
표 그림 61 간편화한 TAG de novo biosynthesis and assembly
표 그림 62 Vector map 모식도
표 그림 63 N. salina와 N.gaditana에서의 전사 전 & 후
표 그림 64 N.salina와 N.gaditana의 PDAT cds 서열 비교
표 그림 65 N. salina와 N.gaditana PDAT에서의 주요 차이점 비교
표 그림 66 N. salina와 N. gaditana의 domain region 비교
표 그림 67 N. salina 및 N. gaditana의 PDAT 예상 구조
표 그림 68 배양 및 Western blotting 결과 (일부)
표 그림 69 Day8과 Day 14에서의 Dry cell weight
표 그림 70 Day 8과 Day 14에서의 FAME contents 비교
표 그림 71 TLC 결과 및 그래프
표 그림 73 N. salina 에서 C source를 저장하는 경로.
표 그림 74 에너지 생성을 위해, 리피드 방울이 분해되는 과정.
표 그림 75 Schematic diagram of enhanced lipid production and secretion to facilitate lipid harvest
표 그림 76 지질수송에 관여된 ABC 수송체 A,G type의 역할
표 그림 77 N. gaditana에서의 ABCA9 타입과의 homology 부분
표 그림 78 각 ABC A타입 후보군들의 유전자 발현정도
표 그림 79 N. salina 내재성 TUB, UEP promoter 에 ABCA6, sh ble 가 삽입되어 있는 DNA
표 그림 80 Secretion of Milk Fat Globule (MFG) in the mammary gland (Heid and Keenan, 2005)
표 그림 10 미세조류내에서의 psbA 프로모터를 활용한 단백질 생산
표 그림 1. 1시간 후, C. reinhardtii 의 응집효율
표 그림 2. C. reinhardtii 과 상등액을 5:5 비율로 섞어주었을 때 응집효과
표 그림 3. 2시간 후, Nannochloropsis salina 의 응집효율
표 그림 4. Myxobacteria 분비물을 섞어준 N. salina 의 성장곡선
표 그림 5. 10일 후에 N. salina 의 Dry cell weight 값
표 그림 6. 10일 동안 배양한 서로 다른 배양액의 색깔
표 그림 7. KYC2844 분비물을 섞어준 배지의 장기배양 결과
표 그림 8. DZ2, KYC1262 and 2065 분비물과 섞어서 배양했을 때, Cell의 크기변화
표 그림 9. 96 well plate 상에서 위치 및 culture volume에 따른 O.D.값의 변화 관찰을 위한 배치도
표 그림 11. 10^6 cells/ml의 농도를 가진 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus, Nannochloropsis salina 에 다양한 농도의 BODIPY 처리 시 얻을 수 있는 fluorescence intensity (488/515)
표 그림 10. 10^6 cells/ml의 농도를 가진 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus, Nannochloropsis salina 에 다양한 농도의 nile red 처리 시 얻을 수 있는 fluorescence intensity (530/575)
표 그림 12. 0.5 ul/ml의 nile red를 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus, Nannochloropsis salina 4종의 미세조류의 농도를 변화시켜 가면서 처리했을 때 얻은 fluorescence intensity (530/575)
표 그림 13. 0.008 ul/ml의 BODIPY를 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus, Nannochloropsis salina 4종의 미세조류의 농도를 변화시켜 가면서 처리했을 때 얻은 fluorescence intensity (488/515)
표 그림 14. 0.004762, 0.007, 0.009524 ul/ml의 BODIPY를 Chlorella vulgaris 의 농도를 변화시켜 가면서 처리했을 때 얻은 fluorescence intensity (488/515)
표 그림 15. 0.004762, 0.007, 0.009524 ul/ml의 BODIPY를 Nannochloropsis salina 의 농도를 변화시켜 가면서 처리했을 때 얻은 fluorescence intensity (488/515)
표 그림 16. 96 well plate에서 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus, Nannochloropsis salina를 각각 0.5, 1, 1.5 g/L의 NaHCO3를 넣어 배양하였을 때 성장 곡선의 변화
표 그림 17. 96 well plate에서 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus, Nannochloropsis salina를 각각 0.5, 1, 1.5 g/L의 NaHCO3를 넣어 배양하였을 때 O.D.값, Fluorescence intensity, nomalized fluorescence intensity. source인 NaHCO3를 사용할 수 있지만, 그렇지 않은 종은 역효과를 가지거나 배양결과에 별다른 영향을 미치지 않았기 때문이라고 사료된다. 결론적으론 NaHCO3가 의 농도가 배양결과에 중대한 영향을 주지 않았다고 판단되었기에 96 well plate에서 배양 시 외부적인 탄소원을 공급하는 것이 필수조건은 아니라고 결론지었다.
표 그림 18. 96 well plate에서 Chlorella vulgaris , Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus dimorphus , Nannochloropsis salina 에 SA, MS, AZ, G3P 4종의 호르몬을 0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 mg/L의 농도로 start 시점과 stationary에 들어가고 2일 뒤에 처리 했을 시 growth와 nile red fluorescence 1차 결과
표 그림 19. 96 well plate에서 Chlorella vulgaris , Chlamydomonas reinhardtii , Scenedesmus dimorphus , Nannochloropsis salina 에 SA, MS, AZ, G3P 4종의 호르몬을 0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 mg/L의 농도로 start 시점과 stationary에 들어가고 2일 뒤에 처리 했을 시 growth와 nile red fluorescence 2차 결과
표 그림 20. CV, NA, SC에 각각 SA, AZ, G3P를 처리하였을 시 성장이 둔화되는 현상
표 그림 21. NA에 Azelaic acid를 처리하였을 때 확연하게 성장이 둔화되는 모습 96 well plate실 배양사진
표 그림 22. CV, SC, CR, NA에 SA와 AZ 처리를 하였을 시 고농도(500-1000mg/L)에서 fluorescence intensity가 2배 정도 증가하는 모습
표 그림 23. MS를 Scenedesmus dimorphus , Nannochloropsis salina 에 처리를 하였을 시특정농도(10, 1mg/L)에서 fluorescence intensity가 2배 정도 증가하는 모습
표 그림 24. Chlorella vulgaris 에 500 mg/L SA, 10 mg/L MS를 처리하였을 시 Growth curve와 nile red fluorescence, TAG assay, FAME analysis 결과
표 그림 25. Chlamydomonas reinhardtii 에 500 mg/L SA, 10 mg/L MS를 처리하였을 시 Growth curve와 nile red fluorescence, TAG assay, FAME analysis 결과
표 그림 27. Nannochloropsis salina 에 500 mg/L SA, 10 mg/L MS를 처리하였을 시 Growth curve와 nile red fluorescence, FAME analysis 결과
표 그림 26. Scenedesmus dimorphus 에 500 mg/L SA, 10 mg/L MS를 처리하였을 시 Growth curve와 nile red fluorescence, FAME analysis 결과
표 그림 28. 번역 억제제의 흡광도 곡선(왼쪽 위), 광합성 효율 곡선(오른쪽 위), 시간에 따른 세포 밀도 변화(왼쪽 아래)와 세포 건조질량 변화(오른쪽 아래).
표 그림 29. 나일 레드 형광을 통한 중성지질량 측정결과.
표 그림 30. C.reinhardtii 에 팔미트산, 스테아르산, 올레산을 처리하였을 때의 흡광도(오른쪽 위), 세포밀도 (왼쪽 위), 나일 레드 형광 (아래) 그래프. 올레산과 팔미트산이 낮은 세포밀도와 높은 형광값을 가짐을 알 수 있다.
표 그림 31. C.reinhardtii 에 EDTA를 처리하였을 때의 시간에 따른 흡광도 변화 (왼쪽)와 배양후 4일 째에 나일 레드 염색하여 형광값을 측정 한 결과 (오른쪽). 실험 결과 EDTA의 농도가 증가할수록 흡광도가 감소하고 나일레드 형광값이 증가하는 것을 알 수 있었다.
표 그림 32. N. salina colony at different condition. (a) noble agar with 80% used media, (b) noble agar with 40% used media, (c) noble agar with 0% used media, (d) bacto agar with 80% used media, (e) bacto agar with 40% used media, (f) bacto agar with 0% used media, (g) agarose with 80% used media, (h) agarose with 40% used media, (i) agarose with 0% used media
표 그림 33. Microscope image of N. salina colony at Noble agar with 40% and 0% used media
표 그림 34 Growth curve of N. salina cultivated in f/2 and 100% used media
표 그림 35 Growth curve of N. salina cultivated in response to used media ratio
표 그림 36. Conditioned media의 혼합율에 따른 30일 후 N. salina 콜로니 크기 비교
표 그림 37. 형질전환 후 도말 한지 21 일 지난 시점에서 N. salina 형질전환체 콜로니 크기 분포도
표 그림 38. Osmotic stress 조건하에서 C. reinhardtii 의 생장과 지질합성
표 그림 39. Osmotic stress 조건하에서Chlorella vulgaris , Nannochloropsis salina )의 생장과 지질합성
표 그림 40. Nitrogen starvation 조건하에서 Chlorella vulgaris 의 생장과 지질합성
표 그림 41. Nitrogen starvation 조건하에서 MAPK 인산화 (C. reinhardtii )
표 그림 42. Osmotic stress 조건하에서 MAPK 인산화 (C. reinhardtii)
표 그림 5: 0.15㎠ 편방의 16x16 microneedle array의 광학 이미지
표 그림 6: 다양한 전압에서 세 가지 물질을 10x10 microneedle array 전극으로 전달 시도;(a) calcein, (b) BSA, 그리고 (c) plasmid DNA encoding GFP
표 그림 7: TAT-β-Gal-FITC는 Jurkat T세포에는 들어갔지만 β-Gal-FITC는 그렇지 않음을 보여주는 fluorescence (위)와 light (아래) confocal microscopy 이미지
표 그림 8: CPP와 결합된 PNA의 세포 내 전달과 발현 여부 시험 기작
표 그림 9: FIB를 이용한 AFM팁의 성형과 AFM팁의 성형 유·무에 따른 세포투과여부 확인(좌), 나노니들의 침투방향에 따른 세포침투에 관한 연구(우)
표 그림10: 나노니들 표면에 thiol기를 이용하여 부착된 QD가 세포 내에서 thiol결합이 끊어져 QD가 세포내부로 삽입되는 모식도(좌), 광학현미경을 통한 QD가 삽입되는 모식도(우)
표 그림11: CVD와 RIE방법을 이용하여 성장된 실리콘 나노와이어와 시간에 변화에 따른 실리콘 나노와이어의 세포삽입정도, 실리콘 나노와이어 위에 배양된 쥐의 신경세포
표 Fig. 15. 바다 미세조류를 이용한 독성 시험.
표 Fig. 16. Apoptosis를 이용한 세포 독성 시험.
표 Fig. 17. 약물이 봉입된 키토산 리포좀의 TEM 사진
표 Fig. 18. 특정 미세주류(Dunaliella salina) 지질 특성 연구.
표 Fig. 19. 효소촉매에 의한 미세조류 지질 추출방법 연구.

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
키워드(keyword) :	-
과제수행기간(LeadAgency) :	-
연구목표(Goal) :	-
연구내용(Abstract) :	-
기대효과(Effect) :	-

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 제목(한글), 저자명(한글), 발행일자, 전자원문, 초록(한글), 초록(영문) 관리번호, 제목(한글), 제목(영문), 저자명(한글), 저자명(영문), 주관연구기관(한글), 주관연구기관(영문), 발행일자, 총페이지수, 주관부처명, 과제시작일, 보고서번호, 과제종료일, 주제분류, 키워드(한글), 전자원문, 키워드(영문), 입수제어번호, 초록(한글), 초록(영문), 목차
저장형식	Text(ASCII format) Excel format
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

바이오연료 생산을 위한 미세조류의 유전적 변형과 생물학적 엔지니어링
Genetic and Biological Engineering of Microalgae for Biofuel Production 원문보기

초록 ▼

Abstract ▼

목차 Contents

표/그림 (138)

표/그림 (138)

참고문헌 (25)

연구과제 타임라인

관련 콘텐츠

원문 보기

이 보고서와 함께 이용한 콘텐츠

연관된 기능

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

연합인증

바이오연료 생산을 위한 미세조류의 유전적 변형과 생물학적 엔지니어링 Genetic and Biological Engineering of Microalgae for Biofuel Production 원문보기

초록 ▼

Abstract ▼

목차 Contents

표/그림 (138) 모든 표/그림 보기

표/그림 (138) 슬라이드로 보기

참고문헌 (25)

연구과제 타임라인

전체(0) 논문(0) 특허(0) 보고서(0)

전체(0) 논문(0) 특허(0) 보고서(0)

관련 콘텐츠

원문 보기

이 보고서와 함께 이용한 콘텐츠

연관된 기능

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

바이오연료 생산을 위한 미세조류의 유전적 변형과 생물학적 엔지니어링
Genetic and Biological Engineering of Microalgae for Biofuel Production 원문보기

표/그림 (138)

표/그림 (138)