초록 ▼

V. 연구개발결과
1. 유자 정유의 생산성 극대화 및 Flavor특성 향상기술의 개발
가. 유자의 과피만을 이용한 생물학적 및 물리적 전처리 공정과 정유 추출 수율:
유자 과피만을 이용한 정유 추출 실험에서는 효소 전처리를 한 후 착즙한 실험 군에서 효소 처리를 하지 않은 실험군보다 약 10배정도의 확연하게 높은 양의 oil이 추출되는 것으로 나타 났다. 한편 효소별 추출 수율은 큰 차이를 보이지 않았다. 시간에 따른 정유추출 수율은 전체 적으로 효소 반응 3시간 사이에 급격한 증가를 보이며 6에서 9시간 사이에 최

V. 연구개발결과
1. 유자 정유의 생산성 극대화 및 Flavor특성 향상기술의 개발
가. 유자의 과피만을 이용한 생물학적 및 물리적 전처리 공정과 정유 추출 수율:
유자 과피만을 이용한 정유 추출 실험에서는 효소 전처리를 한 후 착즙한 실험 군에서 효소 처리를 하지 않은 실험군보다 약 10배정도의 확연하게 높은 양의 oil이 추출되는 것으로 나타 났다. 한편 효소별 추출 수율은 큰 차이를 보이지 않았다. 시간에 따른 정유추출 수율은 전체 적으로 효소 반응 3시간 사이에 급격한 증가를 보이며 6에서 9시간 사이에 최대의 수율을 나 타났다. 이후 시간대에서는 소폭으로 수율의 감소가 나타났다. 따라서 유자 정유 추출의 최대 수율을 보이는 시간은 6시간이 적당한 것으로 나타났다. 결과적으로 수율이 가장 높은 반응시 간인 6시간대의 수율은 약1%대로 나타났으며 이를 기준으로 유자 전체중량에 대한 비율은 평 균 0.33%의 수율로 나타났다. 한편 효소별 반응에 따른 pH는 유의적인 변화를 보이지 않았다.
나. 유자 원과를 이용한 essential oil 추출 수율 및 특성 :
유자 원과를 이용한 정유 주줄 실험에서는 표소반응을 하지 않고 작즙한 유자의 정유주줄 수 율과 효소 반응 후 착즙한 유자 정유추출 수율이 약 2~2.5배정도 높은 수율을 보였다. 또한 과 피만으로 실험하였을 때보다 과육과 씨를 포함한 원과의 정유추출 수율이 0.1~0.2% 높게 나타 났다. 이는 유자 씨에 함유되어 있는 지방산이 일부 추출 된 것으로 보인다. 효소마다 조금씩 차이가 있으나 6시간에서 9시간대 사이의 수율이 가장 높은 것으로 나타났으며 9시간 이후에 는 수율이 감소하는 것으로 나타났다. 결과적으로 수율이 가장 높은 반응 시간대인 6~9시간의 반응 수율은 전체 중량에 대한 비율은 0.3~0.5%로 나타났다.
다. 전처리 조건에 따른 유자 정유의 Flavor profile 특성:
분석 결과 유자의 껍질에서 추출한 정유의 향기성분은 약 60여종이 분리되었으며 그중 35종이 동정 되었다. 주성 분으로는 limonene 55.63%로 가장 많았다. 다음으로는 Y_terpinene이 14.06%의 함량을 보였으며，myrcene，sabinene이 12.73% 다음으로 a-pinene과 P-pinene이 각각 5.45%와 2.04%，P-Farnesene이 2.02%，linalool 1.38%순으로 나타났다. 이와 같은 결과는 다른 연구자들에 연구결과와 유사한 수치를 보였다. 결론적으로 효소처리 후 추출한 정유와 자연적인 정유와의 차 이는 거의 없었으며，효소처리 후 약 9~10배정도의 수율향상을 나타낸 걸로 봤을 때 기존에 자연 에 가까운 천연 유자 향을 추출하기 위해 손으로 직접 유포를 터트리는 방식의 추출방법을 대체 하여 수율적인 측면에서 상업화 가능성이 충분하다고 보여진다. 한편 과피만을 이용한 추출물과 통 유자에서 추출한 Flavor profile간에 유의적 인 차이는 나타지 않았다.
라. 폐 유자박을 이용한 유자 essential oil 생산:
유자 가공 공정시 발생하는 폐유자박의 특성 및 재활용 가능성 여부를 알아보기 위해 고흥에 위치하고 있는 유자 가공 업체를 방문하여 유자 가공시 발생되는 폐유자박을 조사하였다. 유자 폐기물은 크게 2가지로 구분되었으며，가공 전처리시 발생된 폐유자박을 이용하여 정유 성분을 추출하였으나 가공 전처리시 유포낭의 손실로 인해 정유 추출이 불가능하였다. 그러나 상품가 치가 떨어져 착즙만 한 뒤 폐기되는 부산물에서는 유포낭의 손실이 비교적 적어 유자정유 추 출 가능성이 충분히 높다고 판단된다.
마. Pseudomonas sp. NRRL B 2994를 이용한 유자 정유성분의 변화:
실험결과 Pseudomonas sp.에 의해 유자 정유에 존재하는 이중결합의 화합물을 hydroxylation 시켜 유자 정유의 항기성분 변화와 관능적 차이를 알아보기 위해 Pseudomonas sp.을 배양한 후 세포를 sonication한 뒤 각각의 조건에 따라 반응하여 GC/MS 분석 및 관능평가를 실시하였 으나 유의적인 변화를 볼 수 없었다. 향투 실험에서는 hydroxylation 반응 시 NADH를 첨가하 여 반응 여부를 알아보는 실험을 계획 중에 있으며，cell을 sonication하지 않고 배양도중에 유 자 정유를 첨가하여 균체로부터 Microbial transformation을 유도하는 실험을 계획 중에 있다.
바. (FAB I)를 이용한 유자 정유성분의 변화:
NADH-의존성 Enoyl-acyl carrier protein reductase인 FAB I 환원효소에 의하여 유자로부터 추출한 정유에 이중결합을 제거하여 관능적 특성 및 향기성분 변화를 알아보기 위한 실험을 하였다. 먼저 Rseudomonas aeruginosa genomic DNA에서 얻은 FabI gene PCR을 통해서 증 폭한 뒤 재조합 plasmid를 heat-shock 방법을 이용하여 Escherichia coli BL21 (DE3)에 transformation，over expression하였다. 그런 다음 세포를 sonication 한 뒤 gel-filtration chromatography를 이용하여 정제 단계를 통해 1L당 lg의 FAB I 단백질을 확보했다. 확보된 단백질을 이용하여 유자 정유와 각각의 조건에서 반응시킨 뒤 GC분석 결과 유자 정유와 FAB I 간에 일반적인 반응에서는 별다른 변화를 보이지 않았다.
사. 유자의 미생물/효소 전처리 조건에 따른 유자 정유의 Flavor Profile 분석:
세종대로부터 분양 받은 3종의 곰광이의 발육 속도，집락의 표면 및 뒷면의 색조를 관찰한 결 과 발육속도는 yuzu 12，yuzu 2，yuzu 2-1 의 순서로 성장하였으며，집락의 표면과 뒷면의 색상 은 각각 yuzu 2에서 청녹색과 진 노란색，yuzu 2-1 에서는 회색과 밝은 노란색，yuzu 12에서는 회색과 아이보리색에 가까운 색의 특징이 관찰되었다. 또한 각각의 곰광이를 100ml의 PDB 액 체배지에 22T：，150rpm에서 3일간 배양시킨 후 건조중량은 Yuzu 2의 중량이 4.171.20 g/L로 가장 높았고 나머지 균의 중량이 각각 Yuzu 2-1： 3.89〜3.93 g/L, Yuzu 12： 2.0CT2.11 g/L 순으 로 나타났다. 유자 시료에 곰광이를 접종한 뒤 22T：，습도8CT90%，1(厂20일간 배양시킨 후 essential oil의 추출 수율은 소폭 증가 하였으며，이는 곰광이에 의한 세포벽의 분해로 보여진 다. 이들의 향기성분의 변화를 관찰한 결과 배양전의 시료와 큰 차이를 보이지 않았고 주요 성 분으로는 limonene의 함량이 가장 높았으며 다음으로 gamma-terpinene, sabinene, myrcene, beta-pinene，alpha-pinene 순으로 나타났다. 한편 곰광이를 배양시킨 시료에서 시간이 경과함 에 따라 limonene의 함량이 보존되는 경향을 보였다.
아. 저장 온도 및 기 간에 따른 유자 정유의 Flavor Profile 분석 :
저장 온도와 기간에 따른 유자 정유의 향기성분의 변화로는 limonene의 온도별 평균 함량이 70.42%, 70.15%, 69%로 소폭 줄어드는 경향을 보였으며，cymene，bicyclogermacrene등 모노테 르펜 등의 종류는 감소하였다. 반면에 spathulenol，仕iymol등의 함량은 증가하는 경향을 보였다. 또한 4T：에 보관한 시료에서 gamma-lactone의 성분이 다량으로 발견되었고 함량은 각각 30일 9.41%, 60일 1.71%，90일과 120일 시료에서 각각 0.21%，0.07%의 함량으로 저장기간이 증가 할 수록 빠르게 감소하는 경향을 보였다. e仕iyl ester 함량 또한 30，60，90일 시료에서 각각 1.37%, 0.29%, 0.09%로 확인 되었고 120일의 시료에서는 검출되지 않았다.
자. 항산화제 첨가에 따른 유자 정유의 저장 조건별 Flavor Profile 분석 :
BHA(butylated hydroxyanisole), PG(propyl gallate), Tocopherol의 항산화제를 이용한 저장 조건별 유자 정유의 향기 성분을 분석한 결과 3종에 시료에서 공통적으로 bicyclogermacrene, gamma-Terpinene°1 저장 온도와 기간이 증가 할수록 함량이 낮아지는 경향을 보였다. 반면에 spa仕ailenol의 경우 저장온도와 기간이 증가할수록 함량이 증가하는 모습을 보였다. 반면 3종의 항산화제를 첨가한 시료에서 첨가하지 않은 시료보다 향기성분의 변화 정도가 낮아지는 것을 확인하고 향후 항산화제 첨가 함량과 저장 기간을 증가시켜 유자 정유의 향기성분의 변화를 관찰함으로써 저장 및 유통과정에서 발생할 수 있는 유자 정유의 향기성분 변성을 방지하여 양질의 제품으로 산업전반에 응용 가능성을 보여주었다.
2. 유자 정유의 Flavor Profile Analysis 및 생물전환기술을 이용한 정유의 Flavor 특성극대화 기술 개발
가. 유자 정유의 Flavor Profile Analysis 분석 및 미량 방향성분 정성/정량 GC MS 성분 분석
(1) . 유자부위 별 Cold-pressed 유자 정유의 관능평가:
유자의 특징적 향은 크게 5가지로 나눌 수 있음: 즙이 많은/침이 고이는(juicy/salivation)，약 향(medicinal), 떫은향(pungent), 단향(sweet) & 꽃향(floral). 2012년 부위별 유자 essential oil 을 보면 hand-pressed와 Fruit(유자 과육 주줄물)의 essential oil은 에스터향이 강하고，특히 Hand Press는 여러 과일향과 단향이 강했다. 특히 Hand Press의 essential oil은 즙이 많은 향 (신향이 강한)，약향，떫은향과 같은 자극적인 향이 거의 없는 반면 꽃향과 단향은 진한 전체적 으로 호감가는 향이였다
(2) . Distilled 유자 정유의 성분 분석 :
통 유자，albedo를 제거하거나 제거하지 않은 껍질을 사용하여 3가지 증류 유자 정유를 얻었 다. Albedo를 제거한 유자 정유가 가장 투명한 반면，통 유자의 정유는 노란 빛을 띄고 유자 껍질(whole peel - albedo 제거하지 않은)은 검정색이었다. albedo를 제거한 유자 껍질 slurry 는 fiber가 적었지만 albedo를 제거하지 않은 껍질 slurry나 통 유자는 fiber가 많아 증류과정 중 pot에서 껍질이 원활히 섞이지 못해 pot 안쪽에 달라붙어 타버린 것으로 생각된다. 통 유자 slurry는 과즙에서 나온 물이 많아 통 껍질보다 덜 탄 것으로 판단된다.
(3) . Distilled 유자 정유의 관능평가:
2012년도 고흥 유자를 통째，그리고 albedo를 제거하거나 제거하지 않은 껍질에서 얻어진 증류 유자 정유의 관능평가를 실시하였다. Albedo를 제거하지 않은 껍질의 정유는 탄내가 아주 심해 서 정확한 관능평가를 실시하기 어려웠다. 통 껍질을 이용하여 얻은 정유 역시 약간 탄내가 있 어서 정확한 평가가 어려웠으나，유자 특유의 달콤한 꽃향을 감지할 수 있었다. Albedo를 제거 한 껍질로 얻은 정유는 탄내가 없고 가장 fruity하고 floral한 달콤한 향이었다. 더불어 유자 특 유의 떫은 향과 약향도 적절히 갖고 있는 것을 알 수 있었다.
(4). 유자 정유의 GC MS 분석:
재배년도별로 유자 정유의 차이를 알아보기 위해 2⑴8, 2010, 2012년도 냉압착 유자 정유와 증류 유자 정유의 GC-MS 분석을 실시하였다. GC-MS 분석 결과，세 가지 정유에는 대부분 같은 물질이 나왔지만 a-phellandrene은 2010년 유자에만 있었고 2008년이나 2012년 유자에는 없는 것으로 나왔다. 더불어 같은 물질을 함유하고 있다고 해도 년도 마다 물질의 양이 차이가 많이 나는걸 알 수 있었다. 예를 들어 P—phellandrene은 2008, 2010, 2012년도에 각각 1.37, 4.57, 3.21 (area %)를 함유되어 있었다. 이와 같이 농산물인 유자는 aroma profile이 재배년도에 따라 달라진다는 것 을 알 수 있었다. 따라서 일정한 aroma profile의 유자 정유를 지속적으로 생산하기 위해서는 microbial biotransformation을 통해 유자 향을 보완하거나 향상시킬 수 있는 천연 향료 물질을 합성하는 것이 매우 중요하다고 사료된다.
나. Flavor Profile Analysis를 통한 유자정유 부향 향기성분의 동정
(1) . GCyGC MS를 통하여 flavor Profile Analysis：
2008년의 추출된 증류 방식 정유시료와 냉압착 방식으로 추출된 유자 정유의 GC 분석해보니， 2008년 시료가 2010에 비해 peak의 수에 차이가 보였다. 특히 향을 맡았을 때 4가지 시료 중 에서 가장 호감가는 aroma를 갖고 있다고 생각한 냉압착 유자 정유시료를 2010년 두개의 정 유 시료와 비교 시 성분피크가 상대적으로 적었다. 2010년도 두 개의 정유 시료는 상대적으로 무겁고 떫은 향이 강하였는데 아마도 여러 가지 향 물질이 존재하기 때문이라고 추측된다.
(2) . 관능평가를 통한 미 량/특유 정유 성분의 방향 특성 확인:
2008년도와 2010년도의 증류 방식으로 얻은 유자 정유는 쌉싸래하면서도 달콤하고 고무 bottom note를 지니고 있었다. 그리고 2008년도 냉압착 유자 정유는 4가지 정유 중 가장 향기 롭다고 생각되는 aroma profile이 라고 평가되 었다. 냉 압착 유자 정유는 특히 가벼운 꽃 향기 와 시원한 사과，레몬 향，그리고 쌉싸름한 bottom note를 갖는 특징 이 있있다. 마지막으로 2010년 도 냉압착 유자 정유는 가장 비호감의 향을 갖고 있었다. 대체적으로 썩은 음식의 향과 같은 sour 향과 묵직한 고무향을 맡을 수 있었다.
(3) . 부향 성분의 동정:
유자 Essential Oil의 관능 특성을 향상시킬 수 있는 부향성분을 관능평가를 통하여 동정함. 유 자 Essential Oil의 관능평가를 통해 유자 Essential Oil의 관능적 특성을 향상 시킬 수 있는 부 향성분은 Citral / Linanool / Tymol / Nonanal등의 성분이 확인되었다. 부향성분 중 천연 Citral과 Linano이은 Citrus oil의 생산과정 중 부산물로 공급되어 상대적으로 가격이 저 렴하여 Flavor House가 쉽게 사용할 수 있어 Biotransformation에 의한 생산 공정의 개발이 필요하지 않아 시장에 판매되고 있지 않은 천연 Thym이과 Nonanal의 Biotransformation공정 개발을 위 한 특성평가를 실시하였다.
(4) Thymol과 Nonanal 첨가 시 유자 향미 프로필 변화:
유자의 중요한 유효성분으로 알려진 Citral, Linalool，Thymol 중 유자 정유의 질적 향상을 위 한 미생물 생물전환 공정을 위해 생산될 target compound의 선정을 위해 시장 조사를 통해 가 격 경쟁력을 비교하였다. 강한 과일향 또는 꽃향을 부여하기 위하여 Flavors와 Perfume의 소재 로 많이 사용되는 Nonanal을 주가로 평가에 사용하였다. Citral과 Linalool은 Natural 또는 Synthetic 사이의 가격 편차가 크지 않고 상대적으로 저렴한 반면，Thymol과 Nonanal은 단지 Syn仕Letic만이 시장에 판매되고 있으며 가격 경쟁력 또한 우수하다. 따라서 본 연구에서는 Nonanal과 Thymol을 유자 정유에 첨가하여 관능적 특성 변화를 비교하였다.
(5) Tym이과 Nonanal에 의한 유자 Essential Oil의 관능적 특성의 향상:
Thymol을 첨가한 시료는 전반적으로 仕iymol 고유의 탄내가 top-note에 강했으나，middle-note 에는 신내와 꽃향 그리고 단내가 났다. 그러나 농도가 높아질수록 仕iymol 고유의 탄내로 인해 약냄새를 포함한 화학적 냄새가 두드러지게 나타났다. Nonanal의 경우，top-note에 신내와 꽃 향 그리고 비누향이 났으며 middle-note에는 떫은 느낌을 주고 나무향이 났으며 bottom-note 에는 곰광이향이 났다. 농도가 증가함에 따라 꽃향과 신냄새가 증가하였으나，0.005%부터 인위적이고 화학적인 느낌을 주었다. 이러한 결과로 보아，소량의 仕iymol은 middle-note에서 그리 고 nonanal의 경우는 top-note에서 유자 고유의 신내와 꽃향 단내를 부가하여 유자향의 지속성 을 높여 줄 것이라 기대된다. 따라서 thymol과 nonanal을 미생물 생물전환에 의해 천연 합성하 여 유자 정유에 첨가한다면 현재 보다 부가가치가 높은 천연 향료제품으로 개발이 가능하다. 뿐만 아니라，현재 syn仕Letic에 의존하는 thymol과 nonanal 시장에 천연 향료로서의 경쟁력과 기호성(상품성)이 있다.
다. 유자 정유 부향 향기성분의 천연합성을 위한 생물전환기술(Biotransformation) 개발
(1) limonene/citral을 기질로 활용하는 미생물 균주 선발:
GC 분석 결과，10개의 균종에서 citral을 사용했을 때 10개의 균주에서，limonene을 사용했 을 때 9개의 균주에서 피크 변화를 보였으며 2개의 균종은 citral과 limonene 모두 피크 변화 를 보였다. Pseudomonas 종은 8개와 6개가 각각 citral 혹은 limonene을 전환시켰으며 특히 2 개 균주가 citral와 limonene을 모두 전환시킬 수 있었다. Gliiconobacter 종은 2개와 3개가 각 각 citral 혹은 limonene을 전환할 수 있는 능력을 보였다. GC chromatogram에서 citral은 18 분과 19분대에서 각각 peak 하나씩，종 2개 나오고 limonene은 7분대에서 peak가 하나 보이는 걸 알 수 있었다. 그러나 Pseudomonas 혹은 Gluconobacter 균종을 접종하고 24시간 투 다시 GC 분석을 해보았을 때 위에 나와 있는 21종이 각각 citral/limonene 혹은 두가지 모두 생물전 환에 의해 새로운 물질이 형성되어 Citral 혹은 Limonene의 peak 이외의 다른 peak(s)가 검줄 된 것을 확인할 수 있었다.
(2) 천연합성된 물질의 GC MS분석:
GC 분석을 통해 두 가지 기질 농도에서의 미생물의 생물전환 능력을 확인해 본 결과 Pseudomonas Putida KCTC 2198이 800 uL에서，Pseudomonas septica ATCC 14545가 800 uL에서，그리고 Pseudomonas diminuta7' 200，800 uL에서 peak 변화를 보이지 않았다. 이는 기질 200 uL의 전환은 가능하나 800 uL가 첨가됐을시 미생물에게 toxic한 농도가 되어 생물전 환이 불가능했던 것이라 추측된다. 나머지 42가지 샘플의 GC-MS 분석을 통해서 각 미생물이 citral 혹은 limonene을 이용해 생성해낸 물질이 무엇인지 확인해보았다.
(3) 유자 정유의 impact chemical로 사용된 합성 물질:
표 2-24, 25，26에 각각 6—methyl—5—hepten—2_one，carveol, 그리고 carvone을 area %를 기 준으로 21가지 미생물 중 가장 많이 생산한 미생물에서 가장 적게 생산하는 순서대로 나열하 였다. Area %를 기준으로 한 순서이기 때문에 기질을 200 uL 넣었을 시 해당되는 물질을 가 장 많이 생산한 미생물이 가장 효율적인 생물전환을 했다고 해석될 수도 있다. 6-methyl-5—hepten-2-〇ne은 ATCC 1199에 limonene 800 uL를，carve이은 ATCC 17810에 limonene 200 uL를 사용했을 시 carvone은 KCTC 12937에 limonene 800 uL를 사용했을 시 각 각 가장 높은 생산율인 29.62%，13.34%, 그리고 8.51%(area %)를 나타내는 것을 알 수 있었다. 따라서 유자 정유의 impact chemical인 3가지 물질을 가장 많이 혹은 효율적으로 생산한 미생 물을 대상으로 fermentor를 이용해 생물전환 상업적 공정을 개발이 가능할 것으로 생각된다.
(4) Flavor Profile Analysis 및 관능평가를 통한 천연 유자 정유 Creation:
관능평가 결과 0.01% 농도에서 향에선 같은 수의 패널들이 (4:4) carvone과 carved이 들어 간 유자 flavoring을 유자 정유 보다 더 호감이 간다고 표시하였다. 특히 carvone이 들어간 유자 flavoring은 sweetness가 강해지고 floral과 juiciness는 control 보다 약간 더 높아졌으며 약 향과 떫은 향이 더 강해진 것을 알 수 있었다. 맛 평가에서는 0.01%에서는 향료 물질의 향 이 너무 진해 유자 특유의 향이 가려지는 경향이 있어 더 낮은 농도인 0.001%와 0.005%에서 실험을 진행하였다. 그림 2-16에서 보여지는 바와 같이，향료 물질이 더해진 flavoring이 5가지 특성에서 control에 비해 두드러진 차이를 보였다. 특히 6-methyl-5-hepten-2-〇ne은 control보 다 깊고 무거운 맛을 갖고 있어 floral과 juiciness 면에서는 수치가 낮게 나왔다는 것을 알 수 있었다. 0.001%와 0.005%에서 실행된 taste 평가에서는 0.001%의 carvone 과 carveol이 4:3으 로 가장 높은 호감도를 보였다. Base로 쓰여진 유자 정유의 달콤하고 fruity한 향에 minty하고 fresh한 향이 더해져 synergestic 효과를 보인 것으로 평가되었다. 이 두가지 농도에서는 호감가는 flavor 를 만들어 내지 못했으나 다른 농도， 특히 더 낮은 농도에서는 6-methyl-5-hepten-2-〇ne의 바나나와 달콤한 과일 향이 짧은 지속성을 갖은 유자 정유의 fruity하고 floral 한 aroma profile의 향상 효과를 이끌어 낼 것으로 생각된다. 따라서 microbial biotransformation을 통해 얻을 수 있는 nonanal，6-methyl-5-hepten-2-〇ne, carveol 과 carvone은 유자 정유에 첨가되었을 시 각각의 flavor characteristics를 부가해 유자 정유의 aroma 의 표준화 및 quality 를 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다. 향후에는 6-methyl-5-hepten-2-〇ne, carveol과 carvone의 생산에 대한 생물전환 공정 개발에 대한 투속 연구가 필요한 것으로 생각된다.
3. 천연 유자 정유를 기반으로 한식품 제형별천연 유자향 및 Compound Flavor 개발 가. 유자 정유의 GC/Mass 및 Chemical 조합
(1). 유자정유의 GC/Mass 분석
유자의 과피로부터 향취에 기여도가 높은 성분들은 a-pinene， P-pinene， Myrcene, d-limonene, Y—te피inene，p-cymene, Terpinolene, linalool，Sabinene 등과 같이 비교적 함량이 많은 성분도 있지만 Camphene，a—Terpinene，P—Caryophylene，Octanal，Nonanal등의 미 량성분 등도 유효성분으로 나타났다. 또한 비효소처리 Essential Oil과 효소처리 Essential Oil 은 유의 적인 차이가 없으며 관능적으로도 차이가 없었다.
(2). 조합시료의 GC/mass 분석 및 관능테스트
GC/Mass 분석의 결과를 토대로 배합비를 작성한 뒤 유자정유에 향취를 좌우하는 미량 chemical을 조정하여 시료 5종을 제조하여 관능 테스트를 실시하였다. 시료 5종에 대한 관능 테스트 결과 유자 정유와 유사한 향취를 갖는 배합비를 찾을 수 있었다. 하지만 과즙감이나 유 자껍질의 쓴 느낌의 향취 등이 많이 차이가 났다. 천연 유자정유의 경우는 Top Note는 굉장히 좋지만 단점으로 향취의 지속력이 약하고 시간이 경과하면 산폐된다는 단점이 있다. 이에 반면 조합된 합성향료의 경우에 천연 유자정유와 반대로 Top Note는 비교적 약하지만 지속력은 좋은 편이였다.
(3).결론
Citrus계 향료의 가장 중요한 point는 향취의 지속성과 아울러 제품 적용시의 일정한 지속성 을 가지는 것이다. 즉 유자 정유의 가치는 경시 변화에 따른 일정한 품질，유자의 독특하고 강 한 refresh image, 향취의 지속성 이 일정하게 유지되는 것이 중요하다 라고 생각할 수 있다. 천연향료의 분석을 통한 결과에서 유자향료의 품질을 결정할 수 있는 Middle, Last note를 구 성하는 보다 무거운 휘발성 향기성분에 대해서 집중적으로 연구를 하여 chemical을 이용하여 천연향에 가까운 향료의 개발과 이 향료를 이용한 제품개발에 주력하여 하면 더 좋은 제품을 만들 수 있을 것이라 사료된다.
나. 유자정유를 이용한 천연향의 제조 및 경제성 분석
(1). 음료용 천연향 제조
음료용 천연향 제조를 위해 추출한 유자 Essential oil의 비율을 조정하여 E仕iyl alcohol, Water 를 조합하여 주줄 및 부산유를 제거한 결과 유자 Essential oil 10，Ethyl alcohol 120，Water 80의 비율에서 회수율이 92.2%로 가장 낮았으며 Essential oil 20, Ethyl alcohol 120, Water 80 의 회수율이 95.4%였으며，향취의 강도 또한 적절하여 가격적인 측면에서 Essential oil이 적게 사용되고 향의 강도에서도 우수한 Essential oil 20，Ethyl alcohol 120，Water 80의 배합비가 음료용 천연향을 제조하기에 가장 적합한 배합비임을 알 수 있었다.
(2). 낌용 천연향 제조
유자 essential oil에 citrus계열의 essential oil을 첨가한 천연향 제품을 껌에 적용하여 업체에 제시한 결과 #A，#B 및 #：□가 가장 선호도가 높았으며 #C와 #E는 유자의 특징적인 맛과 향을 가려 선호도가 좋지 않았다. 이러한 결과를 반영하여 #A，#B 및 #D를 업체에 제시 하였다.
다. 장기간 보관 중 유분리 등에 대한 문제점 해결을 위한 균질조건 확립(유화향료)
(1). 천연향의 제품 저장에 따른 관능평가
천연 유자향을 저장 조건을 다르게 하여 저장한 후 성상을 관능 test한 결과 저장 기간이 길 어짐에 따라 미세하게 색이 진해졌다. 오븐(50T：)에서 저장했을 시 색의 변화가 가장 컸으며， 다음은 실온(25T〕)，가장 색의 변화가 적은 조건은 냉장(4T：)보관 이었다.
저장조건에 따른 천연 유자향의 GC/MSD분석 결과 몇몇 Peak에서 미세한 높낮이 변화를 보 였으나 전체적으로 큰 변화는 없었다.
3주간의 실험 결과 세 조건 모두 점성에 대한 변화는 없으며 성상은 조금 진해졌으나 육안상 큰 차이가 없는 미세한 변화였다. 향취 또한 저장 기간이 길어질수록 약간 강도가 약해지거나， 오븐 보관 조건 경우 절인 유자 향취가 조금 나타났으나 전체적으로 큰 변화가 없음을 확인하 였다.
흡광도와 TIC는 모든 천연 유자향에서 동일한 패턴을 보였으며 시간이 지남에 따른 약간의 강도차이 만을 나타내었다.
결과를 종합해보면 천연 유자향의 성상，향취 모두 안정성이 뛰어남을 알 수 있었다. 또한 실 온 보관에 이상이 없으며 장기 보관이 필요한 경우 냉장 보관을 통해 품질 유지가 가능한 것 으로 보인다. 또한 수입산 제품과의 품질을 비교한 결과 수입 유자 에센셜 오일보다 효소전처 리 방법으로 추출된 에센셜 오일에서 보다 더 유자 특유의 향기 성분이 분석되었다.
(2). 낌용 천연향의 저장 조건에 따른 관능평가
껌용 천연 유자향의 경시변화의 관찰을 위해 단기실험을 2014. 06. 02(초기값)부터 2014. 06. 20(최종값)까지 3주간 진행 할 예정이며 주 2회총 6회 측정 할 예정이다. 업체에 제시한 5가지 낌용 천연 유자향 중 가장 선호도가 좋았던 #A，#B 및 #D (표 4. 참고)를 이용하여 경시변화 실험을 진행 한 결과 유의적인 차이가 없었다.
라. 천연 유자 정유의 천연향료소제 제품화 및 제품화 적용기술의 개발
(1). 식품 소재 개발 가능성 확인
유자 음료: 국내 flavor의 향료시장은 음료류 38%，빙과류 25%，캔디류 17%，낌류 18%，기타 2% 정도로서 향료 시장에서 음료가 차지하는 비중이 가장 크다고 할 수 있다. 특히 유자는 가 장 대중적인 제품의 형태가 유자 음료이기도 하다. 그러나 현재까지 유자음료의 형태는 단순히 당침법을 이용한 음료의 형태로서 주로 가정에서 소비되는 측면이 있어 음료산업에서의 유자 의 소비는 미비하다고할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 유자농축액 및 유자과즙 유자 향을 이 용하여 음료 제품으로서 적용 가능성을 확인하기 위하여 다음과 같은 배합비로 음료 제품을 개발 하였다.
유자 아이스크림: 유자 향료 및 유자 과즙을 이용하여 소비자의 고급감，natural 지향적으로 fresh하고 유자의 과즙감을 사용하여 여러 기능성을 부각시킴으로서 건강지향적인 제품개발 및 다양성을 요구하는 소비자들의 욕구를 충족시킬 수 있을 것으로 사료된다. 본 실험에서는 유자 향과 유자 과즙을 이용하여 아이스크림 제품에 응용가능성을 확인하기 위하여 아이스크림 제 품을 개발 하였다.
유자 요거트: 유자 소재를 이용한 제품의 다양성 및 유자의 기능성을 부여하여 건강기능식품 의 개발의 필요성이 요구되어지고 있다. 따라서 본 실험에서는 조합된 유자향 및 유자 과즙과 유자 농축액을 이용하여 유제품에 응용 가능성을 확인하기 위하여 유자 요거트 제품에 적용하 여 가능성을 확인 하였다.
유자 젤리: 조합된 유자향 및 유자 과즙액을 이용하여 젤리 제품에 응용 가능성을 확인하기 위하여 제품을 개발하였다.
유자 껌: Gum에 응용하기 위해서 물성 및 지속성(long lasting)이 중요한 요소이다. 유자는 감귤류의 특성상 향의 지속성이 떨어진다는 단점을 가지고 있다. 본 실험에서는 유자 향기성분 의 지속성을 늘리기 위하여 유자향의 조합조건을 달리하여 지속가능한 유자향을 개발하였다. 조합된 유자 향을 이용하여 낌 제품으로서 응용가능성을 확인하기 위하여 제품을 개발하였다.
(2). 향장품 소재 개발 가능성 확인
유자향을 소재로 하여 향자아품 소재로서의 적용 가능성을 확인하기 위하여 유자 세안제 및 비누，입욕제，향초등을 개발 하였다.
(3). 폐유자박을 활용한 동물 사료소재로서 개발 가능성 확인
유자박 사료: 고기능성 성분을 다량 함유하고 있는 유자 부산물을 이용하여 동물성 사료 소 재로서의 가능성을 확인하여 동물에 질병예방과 면역력 증가를 기대할 수 있을 것이라 생각되 어 사료제품에 소재로서 응용하여 제품을 개발 하였다.

Abstract ▼

This study was designed and carried out to investigate new technologies that could be used in improving flavor (chemical) profiles of “Yuzu Essential Oil (oil)” by enzymatic and/or microbial biotransformation，and to develop its commercial applications, such as yuzu flavor formulations.
In this st

This study was designed and carried out to investigate new technologies that could be used in improving flavor (chemical) profiles of “Yuzu Essential Oil (oil)” by enzymatic and/or microbial biotransformation，and to develop its commercial applications, such as yuzu flavor formulations.
In this study, the recovery of yuzu oil was greatly enhanced (i.e，2-10 times) by enzymatic pretreatments of yuzu fruit peels, such as pectinase with cellulase and/or xylanase. In addition, to improve the recovery rate of yuzu oil from yuzu fruit peels, residential fungal cultures, that could be grown on yuzu fruit peels by producing cellulosic degradation enzymes, were isolated. The recovery of yuzu oil has been increased following fungal destruction of yuzu fruit peels. Also yuzu oil could be recovered fellowing yuzu fruit juice extraction (by-product) from Goheung yuzu cultivar. However, flavor (chemical) profiles and quality of yuzu oils, were not affected by either enzymatic and/or microbial pretreatments of yuzu fruit peels. The overall flavor chemical contents of the recovered yuzu oils except limonene were not significantly changed with antioxidant regardless their storage conditions, such as temperature and time.
Yuzu oils were extracted by cold-press and distillation methods. Distilled yuzu oil from yuzu fruit peels without albedo were a clear colored while distilled yuzu oil from yuzu fruit peels with albedo were dark black colored due to burning of albedo during distillation. The yuzu oil extracted from whole fruit had the best quality in color and smells, and was somewhat sweet and floral, but also yuzu characteristic acidic and pungent notes, and had a hint of burnt aroma in sensory evaluation of distilled yuzu oils. These flavor characteristics were important to apply yuzu oil into winning commercial flavor formulations
Recovered yuzu oils were analyzed by qualitative/quantitative GC—MS and sensory analysis to identify characteristic and key trace components that could busting “yuzu” flavor characteristics in essential oil itself and eventually using yuzu flavor formulations. During sensory analysis, thymol and nonanal were identified as “yuzu flavor busters” at lower levels. The addition of thymol and/or nonanal could enhance flavor quality and subsequently improve commercial values of yuzu oil enhancing fruity, floral or refreshing attributes that may contribute to positive effects on the yuzu aroma. However, the supply of natural thymol and nonanal was limited and too expensive to use in flavor formulation. So, it is important to develp a natural processes to produce thymol and nonanal and have a significant commercial value.
Initially, to develop biotransformation processes for the natural biosynthesis of thymol, natural citral and limonene from citrus essential oil extraction that were abundantly available and cheap, were used as a substrate. It was expected that citral and/or limonene might undergo “aromatization” and could be converted into p-cymene and then thymol by microbial biotransformation. The total of 21 species out of 79 microbial species screened, did show capability of transforming citral or limonene into other flavor chemicals, but not thymol. The possibility for the production of value-added natural flavor chemicals from citral and/or limonene is being fully explored.
Contrary to the thymol biotransformation process development, the development of natural nonanal production from nonanol by microbial biotransformation was successful. Gluconobacter cerinus ATCC 23777 was initially screened for this bioconversion of nonanol to nonanal via microbial oxidation reaction. UV mutagenesis was carried out to select G. cerinus super aldehyde producer mutant (SHI). A commercial biotransformation process for the production of natural nonanal was developed at the production level of > 14g/liter in the fermenter.
For the application of yuzu oil into commercial flavor formular that could be used in various food types, such as drinks, beverages, gums, yogults, jellies and icecreams, and household fragrance types, such as soups, facial washer, body washer, air fresheners and candles, various flavor/fragrance were formulated and analysed by GC-MS and sensory evaluation. As an essential oil, yuzu oil had good top notes but less persistency. However, formulated yuzu flavor containing yuzu oil was fairly good top notes with persistency. Yuzu flavor formular were fairly stable in the long-term storages at various temperature (4, 25, and 50 °C).
Recently, the yuzu flavor was formulated by Aromaline, and actually introduced into lower alcoholic beverages “Soju” as a part of this projects in terms of applications and commercialization. The “Yuzu” flavored soju was so popular for young, specially woman, and yuzu flavor production in Aromaline actually contributed its revenue increase in 2015.
In conclusion, the production of yuzu essential oil from Goheung Yuzu cultivar, not just can increase farm incomes, but also can enhance ability natural flavor formulation by not just the production of natural essential oil, but also the application of biotransformation technology for the production of high valued flavor chemicals. The technology developed in this projects eventually improve the competitiveness of Korean flavor and fragrance industry in world.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 16
• CONTENTS ... 18
• 목차 ... 24
• 제 1장 연구개발과제의 개요 ... 29
• 제 1절 연구개발의 목적 ... 30
• 1. 국내외 향료산업의 현황 ... 30
• 2. 국내 향료산업의 문제점 ... 32
• 3. 앞으로의 전망 ... 32
• 제 2장 국내외 기술개발 현황 ... 34
• 제 1절 생산 및 시장현황 ... 35
• 1 국내 제품생산 및 시장 현황 ... 35
• 제 2절 국내 업계 동향 ... 36
• 1. 국내 향료산업 발전의 저해요인 ... 37
• 2. 향료 산업의 발전 방안 ... 37
• 제 3절 국외 관련 기술 ... 38
• 1. 국외 제품생산 및 시장 현황 ... 38
• 제 3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 43
• 제 1절 유자 정유의 생산성 극대화를 위한 생물학적 전처리 기술 개발 ... 44
• 1. 천연향 추출법 ... 44
• 2. 연구내용및결과 ... 45
• 3. 폐 유자박을 이용한 유자 essential oil 생산 ... 62
• 4. 부향 성분 향상 및 주요 부향 성분 확인을 위한 정유의 미생물/효소 처리 공정 ... 64
• 5. 곰광이로부터 생물전환에 따른 유자 정유의 추출 수율 및 향기성분의 변화 ... 71
• 6. 저장 조건에 따른 유자 정유의 Flavor Profile 분석 ... 79
• 7. 결과 및 고찰 ... 107
• 제 2절 유자 정유의 Flavor Profile Analysis 및 생물전환기술을 이용한 정유의 Flavor 특성극대화 기술 개발 ... 110
• 1. 유자 정유의 Flavor Profile Analysis 분석 및 미량 방향성분 정성/정량 GC MS 성분 분석 ... 110
• 2. Flavor Profile Analysis를 통한 유자정유 부향 향기성분의 동정 ... 124
• 3. 유자 정유 부향 향기성분의 천연합성을 위한 생물전환기술(Biotransformation) 개발 ... 132
• 제 3절 천연 유자 정유의 천연향료소재제품화 및 제품화 적용기술의 개발 ... 167
• 1. 천연소재로부터 향료를 개발하는 방법 ... 167
• 2. GC/Mass분석 에 따른 Chemical 조합 ... 170
• 3. 유자정유를 이용한 천연향의 제조 및 경제성 분석 ... 175
• 4. 장기간 보관 중 유분리 등에 대한 문제점 해결을 위한 균질조건 확립(유화향료) ... 177
• 5. 천연향의 제품 저장에 따른 관능평가 ... 178
• 6. 식품 소재 개발 가능성 확인 ... 189
• 7. 향장품 소재 개발 가능성 확인 ... 198
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 202
• 제 1절 연구개발 착안점 및 달성도 ... 203
• 1. 연구계획시의 착안점 ... 203
• 2. 연구수행후의달성도 ... 205
• 제 2절 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 207
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 208
• 제 1절 연구 활동 방안 ... 209
• 제 2절 추가 연구의 필요성 ... 209
• 제 3절 경제적 성과 ... 210
• 제 6 장 참고문헌 ... 224
• 끝페이지 ... 229