초록 ▼

V. 연구 결과
1. 동맥경화 관련 혈관기능에 대한 산국추출물 EO의 효과 검증
- EO는 고농도에서 in vitro 혈관 평활근세포에 대해 독성을 나타내었으나, 수용성 EO는 어 떤 농도에서도 독성을 나타내지 않음. 따라서 수용성 EO의 효과가 검증됨.
- PDGF에 의해 자극된 세포이동은 고농도 EO에 의해 억제경향을 나타내었으나, 수용성 EO 에 의해서는 농도 의존적인 억제를 나타냄. PDGF에 의해 자극된 세포증식은 고농도 EO에 서만 억제경향을 나타내었으며, 수용성 EO에 의해서는 농도 의존적으로 약화됨.

V. 연구 결과
1. 동맥경화 관련 혈관기능에 대한 산국추출물 EO의 효과 검증
- EO는 고농도에서 in vitro 혈관 평활근세포에 대해 독성을 나타내었으나, 수용성 EO는 어 떤 농도에서도 독성을 나타내지 않음. 따라서 수용성 EO의 효과가 검증됨.
- PDGF에 의해 자극된 세포이동은 고농도 EO에 의해 억제경향을 나타내었으나, 수용성 EO 에 의해서는 농도 의존적인 억제를 나타냄. PDGF에 의해 자극된 세포증식은 고농도 EO에 서만 억제경향을 나타내었으며, 수용성 EO에 의해서는 농도 의존적으로 약화됨. 한편, PDGF로 유도되는 혈관 싹 성장은 수용성 EO에 의해 농도 의존적으로 억제됨.
- 혈관평활근세포의 이동 및 증식과 관련된 신호전달 단백질들(PDGF 수용기 및 MAPK등) 의 PDGF에 의한 인산화 증가가 수용성 EO에 의해 억제되는 경향을 나타냄.
- 동맥경화모델의 혈관신생내막 형성이 EO처리에 의해 억제되는 것이 관찰됨.
- 이상의 결과들은 산국추출물 EO는 PDGF-MAPK경로억제를 통한 혈관평활근 세포의 증식 및 이동을 억제를 통해 신생내막형성의 억제를 유도하여 동맥경화 반응을 약화시킬 가능성 을 제시함.
2. 산국추출물의 고혈압관련 혈관반응에 대한 EO효과 검증 ⑴ 수용성 EO
- 대동맥 혈관평활근 수축/이완능에 미치는 영향: 대동맥 평활근의 안정장력은 수용성 EO 처리에 의해 다소 약화되는 반응을 보임. KC1 에 의한 혈관평활근 수축은 수용성 EO 전처리 에 의해 내피존재 및 부재조건에서 모두 강력히 억제됨. NE에 의한 혈관수축은 수용성 EO 전처리에 의해 내피부재조건에서 감소하는 경향을 보이지만, 내피존재 하에서는 영향을 나 타내지 않음. 한편, 수용성 EO는 acetylcholine (Ach)에 의해 발생하는 내피의존성이완을 다 소 억제하는 경향을 나타내었으며, 고농도 KC1 및 norepinephrine (NE)로 발생된 수축을 농 도 의존적으로 이완시킴. 그러므로 수용성 EO는 혈관수축을 억제하며, 혈관 이완을 유도할 것으로 예상됨.
- 폐동맥의 수축/이완능에 미치는 영향: 고농도 KC1 및 NE에 의한 내피존재 및 부재의 혈 관평활근 수축은 수용성 EO 전처리에 의해 억제되는 것으로 나타남. 수용성 EO는 KC1 및 NE로 유도된 내피 부재의 혈관수축을 농도 의존적으로 감소시킴. 따라서 폐동맥 수축에 대 한 수용성 EO의 효과는 대동맥과 비슷한 수축/이완 효과를 나타 낼 가능성이 있음.
(2) 지용성 EO
- 혈관 수축/이완능에 대한 효과 : 내피존재 및 부재하의 혈관평활근의 안정장력은 EO처리 에 의해 가볍게 약화되는 경향을 나타내었으며, endothelin (ET)-l 및 serotonin (5-HT) 에 의한 혈관수축은 EO의 전처리에 의해 억제되는 경향을 나타냄. NE에 의한 혈관수축은 EO 전처리에 의해 크게 억제되는 경향을 나타냄. 한편 NE 및 고농도 KC1 로 유도된 내피존재 및 부재의 혈관수축은 EO 농도 의존적인 이완반응을 나타냄. 따라서 EO에 의한 폐동맥 수 축/이완은 수축의 억제 및 이완유도 효과를 가진 성분이 존재할 것으로 사료됨. -고혈압모델동물에 EO 을 투여한 바, 혈압을 감소시키는 경향이 관찰됨.
-이상의 결과들은 산국추출물 EO가 고혈압을 개선시킬 가능성을 가진 물질임을 시사함.
3. 심혈관질환 (동맥경화 및 고혈압)관련 factor 들에 대한 EO의 효능 검토
(1) 심혈관질환 관련 세포의 반응에 대한 EO효과
-내피세포 성장인자인 VEGF에 의한 혈관내피세포(HUVEC)의 이동/증식 및 혈관싹 생성은 수용성EO처리에 의해 약화되는 경향을 보임. 한편, 염증사이토 카인 (LPS)에 의해 증가된 NO생산 및 NOS의 증가가 수용성EO처리에 의해 감소됨. 따라서 수용성EO는 혈관기능을 보호할 수 있는 유익한 물질일 것으로 사료됨.
-심근세포에서 TNF-a에 의해 유도된 apoptosis 및 ROS (0₂_ 및 H20₂) 발생은 수용성EO처리 에 의해 감소되는 경향을 나타냄. 한편, Miconazole에 의한 심근세포의 beating수 감소는 수 용성 EO처리에 의해 회복됨. 이들 결과는 수용성EO가 심장세포에서의 심혈관질환(동맥경화 및 고혈압)과 관련된 apoptosis 및 ROS 발생에 대해 억제효능을 가지며, 심근세포기능에 대 해 보호 효능을 나타낼 가능성을 시사함.
-Angiotensin II (Ang II)에 의한 신장세포에서의 전섬유화인자 collagen type 1, fibronetin 1, PAI-1 발현 증가는 수용성EO 처리에 의해 모두 약화되는 경향을 나타냈으며, TGF-욘의 발현은 다소 증가됨. 이들 결과들은 수용성EO가 전섬유화인자의 발현을 감소시켜 신장 보 호에 효능을 가질 가능성을 시사함.
-결론적으로 수용성 EO는 이들 세포들에서 심혈관질환 관련 반응들에 대해 유익한 효과를 발휘할 수 있는 물질로 사료됨.
(2) 산화스트레스연관 단백질 발현에 대한 EO 효과
- 혈관평활근세포에서 PDGF 및 Ang II 에 의한 Ref-1, PRR 및 DJ-1 의 발현증가가 수용성 EO의 처리에 의해 대체적으로 감소되는 경향을 나타냄.
- 혈관내피에서 TNF-a에 의한 Ref-1, DJ-1 및 PRR 단백질의 발현증가는 수용성EO처리에 의 해 감소되는 경향을 나타냄.
- 심근세포에서 TNF-a에 의해 유도되는 Ref-1, Prx3, DJ-1 의 발현증가는 수용성 EO처리로 약화되지만, 묘요묘의 발현에는 억제효과를 나타내지 못하는 것으로 관찰됨.
- 신장세포에서 Ang II의 자극에 의한 전섬유화인자 Collagen type 1, Fibronetin 1, PAI-1 의 발현증가는 수용성EO 처리에 의해 모두 약화되나, TGF-P의 발현은 다소 증가하는 경향으로 나타남.
-그러므로, 수용성EO는 심혈관관련 산화스트레스성 관련 단백질의 발현을 억제할 수 있는 능력을 가진 물질일 가능성이 있음.
4. 산국 EO로부터 분리된 순수성분의 혈관기능연구
(1) 산국 EO로 부터 순수성분 분리 및 monoterpine과 single compounds의 확보
- Gas chromatography-mass spectrometry (GS/MS)를 이용하여 EOS* 분석한 바, 총 42가지 의 성분이 분석되었으며, 이들 중 혈관기능이 명확하지 않은 성분 17가지 (monoterpine, 15 종; sesquiterpene, 2종)를 선택하여 본 연구를 수행함. 이중 일부 성분은 EO로부터 분리 정 제하여 사용하였으며, 일부 물질은 구입하여 사용함.
(2) 동맥경화 관련 혈관반응에 대한 EO 순수성분의 효과 검증
-EO 순수성분으로 처리된 혈관평활근세포의 안정성 시험에서 80% 이상 생존능을 보인 성분 들은 camphor, camphene, terpinolene, beta-pinene의 monopterpene류 이었음. 이들 순수성 분 들 중 camphor 및 terpinolene은 생존능이 거의 100%인 것으로 관찰됨.
- 이들 물질중 terpinolene은 혈관평활근 세포의 증식 및 이동을 보다 효과적으로 억제하는 것으로 관찰됨.
- 동맥경화 모델 동물의 혈관 신생내막형성은 terpinolene에 의해 억제되는 경향을 나타냄.
- 그러므로, monoterpene류의 EO 순수성분인 terpinoloene이 동맥경화 개선에 영향을 미칠 유용한 가능성 물질로서의 역할이 예상됨.
(3) 고혈압관련 혈관반응에 대한 EO 순수성분의 효과 검증
-EO 순수성분들 중 piperitone은 35 mM KC1 및 0.1 yM NE에 의한 내피 존재 및 부재의 폐동맥 수축에 대해 이완효과를 나타내었으며, monoterpene류인 piperitone은 가장 효과적 인 이완효능을 유발하는 것으로 나타났음.
-Piperitone은 내피존재 및 부재하의폐동맥의 안정장력을 농도 의존적으로 이완시킴.
-Ach에 의해 발생하는 내피의존성이완은 비처리혈관에 비해 Piperitone의 처리군이 더 컸음. -ET-1 에 의한 내피 부재 또는 존재하의 혈관들의 수축증가반응은 EO 순수성분인 piperitone 의 전처리에 의해 억제되는 경향을 나타냄.
-Piperitone 에 의한 폐동맥이완 효과가 L-NAME 처리에 의해서는 영향이 없었으나, Indomethacin 전처리에 의해서 약간의 억제 경향을 보임.
-내피 존재 및 부재하의 폐동맥에 있어서 NE로 유도된 수축의 SNP (sodium nitropruside, NO donor)에 의한 이완은 piperitone 처리군 및 비 처리군 사이에 반응차이를 나타내지 않 음-
-Piperitone 은 혈관 평활근세포의 Ca²⁺ channel을 op«i을 억제하는 경향을 나타냄.
-따라서, Piperitone에 의한 혈관수축력의 억제는 Ca²⁺ channel의 억제와 관련 될 가능성이 있을 것으로 사료됨.
-Piperitone은 투여일 의존적으로 고혈압 저하 효과를 나타냄.
-결론적으로' 이상의 결과는 monoterpene류인 EO 순수성분 piperitone은 Ca²⁺ channel을 억 제함으로써 혈압을 저하 시킬 수 있는 물질일 가능성을 제시함.
5. 심혈관질환 (동맥경화 및 고혈압)관련 factor 들에 대한 EO 순수성분의 효능 검토
(1) 혈관평활근세포에서 EO 순수성분의 영향
- 혈관평활근세포에서 ketoconzaole 또는 Ang II에 의해 유도되는 ROS 및 apoptosis 발생은 EO 순수성분 중 terpinolene 처리에 의해 억제되는 경향을 나타내었으나, beta-pinene을 처 리한 군에서는 ROS 만을 억제하며 apoptosis에는 영향을 주지 않았음.
-혈관평활근세포에서의 ketoconazole에 의한 DJ-1, 및 Bax의 발현변화는 monoterpene류 terminolen 및 beta-pinen에 의해 억제되는 경향을 나타냄.
-이들 결과로부터 terpinolene은 혈관평활근세포에서의 심혈관질환(동맥경화 및 고혈압)과 관 련된 factor들의 활성을 억제할 가능성을 소유한 물질로서 예상됨.
(2) 심근세포에서 EO 순수성분의 영향
-EO순수성분 중 ketoconazole및 Ang II에 노출된 심근세포에서 유도되는 ROS 발생은 terpinolene 및 beta-pinene에 처리에 의해 다소 약화되는 경향을 보임. 한편, ketoconazole 및 Ang II 처리 후, 발생된 apoptosis는 terpinolene에 의해서만 억제경향을 보이나, beta-pinen의 처리에 의해서는 거의 영향을 받지 않는 것으로 관찰됨.
- Ketoconazole에 노출 된 심근세포에서의 Prx3, DJ-1 및 Bax 의 발현 변화는 monoterpene 류인 terpinolen 및 beta-pinen에 처리에 의해 억제되는 경향을 나타내었으며, Ang II에 의한 DJ-1 및 Bax의 발현 변화는 terpinolene의 처리에 의해 감소되는 것으로 관찰됨.
-이들 결과는 terpinolene은 심근세포에서의 심혈관질환 관련 factor의 능력을 억제시키는데 효과를 발휘할 가능성 물질임을 시사함.
(3) 신장세포에서의 관련 반응에 대한 EO 순수성분의 효능
-Terpinolene 은 Ang II로 유도된 신장세포에서의 전섬유화인자 collagen type 1 및 出bronetin 1의 변화를 억제하는 경향을 나타내었으나, PAI-1 및 TGF-P의 발현변화에는 영 향이 없는 것으로 나타남.
-이들 결과들로부터, Terpinolene은 전섬유화인자의 발현을 감소시키는데 있어서 효능을 가 질 것으로 사료됨.
(4) 폐조직에서 관련 단백질 발현에 대한 EO 순수성분의 효과
-Phellandrene은 ICAM-1, COX2, NF-kb등의 염증관련 factor 및 apoptosis 관련 Bax 의 발현 변화에 거의 영향을 주지 않았음. 한편, piperitone은 COX2 및 Bax, NF-kb의 발현에 거의 영향을 주지 않았으나, ICAM-1 의 발현을 증가시키는 경향을 나타냄.
-이 결과들은 폐조직에서 piperitone이 염증반응에 대해 이상성을 나타낼 가능성을 제시함.
6. 산국화 EO의 안정성 연구
(1) 산국화 EO의 설치류 급성경구독성시험연구
-산국화 EO를 단회 경구 투여 후 14일간 관찰한 바, 산국화 EO은 임상증상, 체중 및 사료 섭취량의 변화 둥이 관찰되지 않았고, 관찰기간 종료 후 실시한 육안적 병리검사에서 이상 관찰되지 않음. 또한 관찰종료일까지 사망동물이 관찰되지 않았음. 따라서 경구 노출에 의한 독성이 없는 안전한 물질로 판단되었음.
(2) 산국화 EO의 설치류 급성경피독성시험연구
-산국화 EO를 단회 경피 투여 후 14일간 관찰 한 바, 산국화 EO는 임상증상, 체중 및 사료 섭취량의 변화 등이 관찰되지 않았고, 관찰기간 종료 후 실시한 육안적 병리검사에서 이상 이 관찰되지 않음. 또한 관찰종료일까지 사망동물이 관찰되지 않았음. 따라서 경피 노출에 의한 독성이 없는 안전한 물질로 판단되었음.
(3) 산국화 EO의 설치류 반복독성시험연구
-산국화 EO에 대한 14일간 반복 경구투여 하였을 때 나타나는 전신 독성을 확인하여 독성 양상을 확인하고자 시험물질을 1회/일, 14일간 반복적으로 강제 경구 투여하여 시험물질에 대한 독성 정보를 확보하였음. 그 결과, 산국화 EO의 본 제품은 임상증상, 체중 및 사료 섭 취량의 변화 등이 관찰되지 않았고, 관찰기간 종료 후 실시한 혈액검사, 뇨화학치 검사, 부 검 후 육안검사 및 장기중량 측정에서 이상이 관찰되지 않았으며, 관찰종료일까지 사망동물 이 관찰되지 않았음. 본 시험 조건에서 무독성량은 5 ml/kg bw/day인 것으로 평가되었음.
(4) 산국화 EO의 설치류 급성흡입독성시험연구
-산국화 EO의 100배 희석액 (19,〇7〇 ppm) 및 1◦배 희석액 (190,700 ppm)으로 4시간 노출시킴. 관찰기간 종료 후 육안적 병리검사를 실시한 결과, 노출군 및 음성대조군 모두에서 어떠한 이 상소견도 관찰되지 않았으며, 시험동물들의 폐 및 기타 여러 장기에 이상증상이 나타나지 않 았음. 무처치군과 비교하여 체중 및 사료섭취량과 음수량에 큰 차이를 보이지 않았으며, 시험 기간 종료일까지 사망동물이 발생하지 않았음. 따라서 산국화 EO의 흡입독성은 아주 안전한 것으로 판단되었음.
7. 산국성분을 이용한 혈관질환 치료제/완화제의 시제품개발
(1) 기능연구 결과를 바탕으로 임상시험용 시제품을 개발함
(2) 동맥경화 개선 시제품: 시판되고 있는 기존의 EO 함유 제품들의 액상차의 형태로 응용이 많 음을 참고하였으며, 또한 순환기 전문가 및 내과 전문가의 조언을 바탕으로 하여 산국 EO성분 (floral water) 함유한 액상차의 제형으로 개발함. 산국 EO성분의 체내 흡수율이 우수한 배합비 를 최종 설정하여 액상차형 (vial)으로 (주)동서제약 웰빙에 주문 제작함.
(3) 고혈압 개선 시제품: 순환기 전문가 및 내과 전문가의 조언을 바탕으로 하여 병태에 효과적 인 산국 EO성분을 함유한 스프레이형 (2종)의 제형으로 개발함. 산국 EO성분의 체내 흡수율이 우수한 배합비를 최종 설정하여 액상차형 (vial)으로 (주)동서제약 웰빙에 주문 제작함.
(4) 시제품의 효능 검사
-동맥경화 개선 시제품의 항동맥경화 효능검사: in vivo 동맥경화 모델에서 형성된 신생내막 의 형성정도를 시제품과 동일 조건의 수용성EO에 대한 효과를 처리 군과 비처리 군에서 서 로 비교 검토함. 그 결과, 수용성EO 처리군은 신생내막 형성이 다소 약화되는 경향을 나타 냄. 그러므로, 액상차 시제품은 동맥경화에 중요과정인 신생내막형성의 억제에 효과를 나타 낼 가능성이 있는 제품으로 예상됨. 그러나 향후 임상적용 및 시판을 위해서는 보다 장기간 투여시의 효과 등 보다 세밀한 연구 또한 중요할 것으로 사료됨.
-고혈압 개선 시제품의 항고혈압 효능검사 : monoclotaline으로 유도된 폐성고혈압 in vivo 모델동물을 이용하여 폐성 고혈압에 대한 고혈압 개선 시제품의 효능을 검사하기위하여, 폐 성 고혈압의 대표적인 병태 증상인 심장 및 폐동맥의 병태 비교분석함. 시제품과 동일조건 의 EO를 폐성 고혈압 모델 동물에 흡입처리 후 처리군과 비처리 군의 조직병태정도를 확인 함. 그 결과, monocrotaline으로 유도된 폐성 고혈압 동물의 대표적 인 병태인 우심실벽 비대 및 폐동맥벽 비대가 EO처리에 의해 다소 감소되는 경향을 나타내었음. 따라서 고혈압 개선 용 시제품은 폐성 고혈압의 중요 병태를 억제 가능한 경향을 나타내는 것으로 관찰됨으로써 폐성고혈압의 개선에 유용한 제품으로서의 역할이 예상됨. 그러나 향후 임상적용 및 시판을 위해서는 보다 장기간 투여시의 효과 등 보다 세밀한 연구 또한 중요할 것으로 사료됨.
-염증 유도관련 단백질 발현에 대한 효과 확인 : 혈관 평활근세포에 시제품 동일조건 및 농 도의 EO를 처리 시 염증자극 물질에 의해 유도된 관련 단백질 발현 증가가 약화되며, 인간 유래혈관내피세포 (HUVEC)에서의 염증유도인자 및 caspase 3의 발현 증가가 감소하는 경 향으로 관찰됨. 한편, 심근세포에서 ketoconazole로 유도된 세포독성 및 Bax 발현 또한 시제 품 동일조건 농도 EO처리에 의해 약화되는 경향을 나타냄. 이상의 결과들은 EO가 혈관평활 근 및 내피세포에서의 염증반응의 억제 효과 및 심근세포 기능에 대해 양성효과를 나타낼 가능성을 제시함.
(5) 산국 EO 성분 함유 시제품 인체 간이 임상시험
- 내과 전문의와의 컨설팅을 통해 제작된 임상시험용 시제품의 인체 안정성 검증을 위한 간 이 임상시험을 수행하기 위하여 IRB 신청서을 건국대학교 IRB위원회에 제출함 (신청번호: KUCH 2015-09-041; 수행처: 건국대학교충주병원).
8. 한국자생식물 산국 EO의 개발
(1) 산국화 재배조건 확립: 야생 산국화를 채취하여, 호서대학교 한방화장품과학과 실습지내 배
수시설 확충 및 배수가 잘 되는 토양을 선택하여 재배지를 3000평 확립하여, 산국화 재배지의 제초작업의 보완을 위해 부직포/비닐 멀칭 설비를 구축하였음. 개화 시기 별 EO 성분의 비교 를 위해 재배지에 구역을 나누어 채취시기를 조절하였으며, 산국 EO 구성 성분 중 특이적인 성분의 분리를 위해 지역을 달리하여 채취함으로써 채취 시기 및 지역별 EO 성분 연구를 위한 조건을 확립함.
(2) 산국화 EO의 추출 환경 및 기기의 확립 : 호서대학교 한방화장품과학과 실습지 내 EO 전용 추출 및 분리를 위한 추출실을 확보 및 셋팅 하였음. 기존의 추출기의 단점을 보완한 대용량/고 효율의 steam distillation 추출기 2대 및 다양한 한국 자생식물 E〇 추출 및 연구에 사용될 간이 추출기 1대를 설치하였으며, 기타 농축기 1대, absolute 추출장비, 압착 추출 장비 등 확보함.
(3) 분리방법의 최적화 확립 : 산국 EO의 분리를 위하여 steam distillation, absolute extraction, 초고압 추출법 및 초임계 추출법을 적용한 바, 산국 EO의 분리 및 정제는 steam distillation 방 법이 가장 최적화된 방법임이 확인됨.
(4) 산국화 EO의 성분분석 및 효능검증
(가) 성분분석: 본 연구진은 보유 추출기법(100% 증류수를 이용; 꽃이 피기 직전에 수확)을 활용하여 추출한 산국화 EO를 GC/MS로 분석하여 42개의 성분을 동정하였음. 이중 대부분 은 monoterpene 및 sesquiterpene 성분임을 확인함. 한편, 산국화 EO 분리 후 수용액층인 수용성 E〇 (floral water)의 성분분석을 GC-MS를 활용하여 분석(의뢰: 한국기초과학지원연구 원, KBSI, 서울서부센터)하여, 작용이 알려지지 않는 4성분 및 다양한 기능을 가지는 3성분 총 7개 성분이 함유되는 것으로 확인함.
(나) 산국화 EO의 비 심혈관계 효능: 상처치유 및 피부재생효과, 항산화 효능(free radical 소거 능), 항비만 효능등을 확인함.
(5) 산국화 essential oil의 수득률 및 성분의 최적화
(가) 개화 시기에 따른 산국화 EO의 수득를, 성분 및 효능검증
① 개화 시기에 따른 산국화 EO의 성분 및 수득률 검증
-개화 전(vegetative)，개화 중(pre-flowering)，개화 후(full-flowering)후로 구분하여 채취한 산국화를 steam distillation 방법을 활용하여 추출된 EO의 수득률을 확인함. 그 결과 개화 중 에 수득률이 가장 높게 나타났으며, 개화 후에는 수득률이 감소되는 경향을 보임.
-채취 시기별로 분리된 산국화 EO의 성분 분석을 한국기초과학지원연구원(KBSI, 서울서부센 터)에 의뢰하여 GC/M5를 이용하여 분석함. 개화시기에 따른 산국화 EO 성분의 변화는 개화 중에 P-ttiujone, umbellulon, P-phellandrene등을 포함한 7가지 성분이 특이적으로 존재하였 음. 개화 전, 개화 중, 개화 후 시기에 모두 monoterpenes의 함량이 높았으며, 특히 개화 중 시기 부터 monoterpenes 성분의 증가와 더불어 sequiterpene 성분의 감소가 관찰됨. 개화전의 EO성분 중 sesquiterpene 성분의 일부는 꽃이 완전히 개화되고 난 후 상태에서 일부 감소가 관찰됨.
② 채취시기별 산국화 EO의 효능
-개화 중 시기의 EO 는 EGF 에 비해 높은 keratinocyte 및 fibroblast 의 proliferation/migration을 유도하는 것이 확인됨. 반면，개화전 과 개화 후 시기에 채취한 산국화 EO는 유의한 효과를 나타내지 않음.
-산국화 EO은 채취시기에 따른 항산화 효능의 차이는 나타내지 않았으나, 공통적으로 유사 한 항산화 활성을 나타냄.
(나) 채취 지역별 산국화 EO의 수득률, 성분 및 효능검증
① 채취지역에 따른 산국화 EO의 수득률 및 성분 검증 :
- 북부(한계령 정상 인근), 중부(충남 아산), 남부(남해군청 인근)에서 개화 전(pre-flowering) 상태의 산국화를 채취하여 steam distillation 법을 활용하여 얻은 EO의 수득률은 중부-남부 -북부 순으로 수득률이 높았음. 따라서, 중부 지역(충남 아산)이 EO 분리용 산국화 재배에 있어서 최적지임을 확인함.
-지역별로 분리된 산국화 EO의 성분 분석은 한국기초과학지원연구원(KBSI, 서울서부센터) 에 의뢰하여 GC/MS를 활용하여 분석하여, 총 37개의 성분을 확임함. 북부(강원 설악, 한계 령), 중부(충남 아산) 및 남부(경남 남해)에서 모두 monoterpenes의 함량이 높게 나타남. 또한 중부(충남 아산)지역의 산국화 EO 성분에서 monoterpenes 및 sesquiterpenes 성분의 함량이 북부 또는 남부 지역에 비해 높게 나타남.
② 채취지역에 따른 산국화 EO의 효능 검증
-중부(충남 아산)에서 채취한 산국화 EO는 EGF에 비해 유의적인 fibroblast 증식/이주능을 유 도한 반면, 북부(강원 설악, 한계령)와 남부(경남 남해)에 채취한 산국화 EO는 증식 및 이주능 이 관찰되지 않음.
-산국화 EO는 채취지역에 따른 항산화 효능의 차이는 나타내지 않았으나, 공통적으로 유사한 항산화 활성을 나타냄.

Abstract ▼

V. Results
1. Effects of CBM extracts on atherosclerosis-linked vascular responses
- CBM EO had a toxic activity on VSMCs at high concentration but CBM floral water (FW) did not affect it at any concentration. Thus, we explored the effect of CBM FW on vascular disease-related vascular response

V. Results
1. Effects of CBM extracts on atherosclerosis-linked vascular responses
- CBM EO had a toxic activity on VSMCs at high concentration but CBM floral water (FW) did not affect it at any concentration. Thus, we explored the effect of CBM FW on vascular disease-related vascular responses.
- PDGF-induced VSMC migration was inhibited only by treatment with high concentration of CBM EO but was attenuated by CBM FW in dose-dependent manner. Moreover, CBM FW dose-dependently suppressed PDGF-stimulated vascular sprout outgrowth. Therefore, this result implys that CBM FW can have anti-atherosclerosis activity.
- CBM FW attenuated the PDGF-increased the phosphorylation of migration- or proliferation-participating proteins such as PDGF-receptor and MAPKs in VSMCs. Moreover, rat vascular neointima formation was inhibited by administration with CBM FW.
- These results suggest that CBM FW may inhibit neointima formation by suppressing VSMC migration and proliferation mediated by PDGF-receptor-mediated MAPK pathway. Therefore, CBM FW may a promising material for drug development to treat or prevent atherosclerosis.
2. Effects of CBM extracts in hypertension-linked vascular responses
(1) CBM FW
- Aortic contraction and relaxation: CBM FW weakly inhibited vascular resting tension. KCl-induced contraction in endothelium intact and free aortas was strongly inhibited by pretreatment with CBM FW. However, Norepinephrine (NE)-induced contraction was inhibited by pretreatment with CBM FW in endothelium free aortas but not in endothelium intact aortas. Acetylcholine (Ach)-induced endothelium-dependent relaxation in aorta was weaky attenuated by CBM FW. In addition, CBM FW inhibited 35 mM KC1- and 0.1 uM NE-induced contractions in aorta in a dose-dependent manner. These results suggest that CBM FW may have relaxation activity in aortas.
- Contraction and relaxation in pulmonary artery: Pretreatment with CBM FW resulted in inhibition of KCI-and NE-induced contraction in endothelium-intact or-free pulmonary artery. Moreover, CBM FW dose-dependently attenuated 35 mM KCI-and 0.1 μM NE-contractions in pulmonary artery. These results suggest that these responeses to CBM FW in pulmonary artery were similar to those in aortas.
(2) CBM EO
- Contraction under relaxation in pulmonary artery: CBM EO weakly inhibited vascular resting tension under endothelium intact or free conditions. Pretreatment with CBM EO inhibited serotonin-, endothelin (ET)-1, or NE-indeced contractions in endothelium int act and free vessels. In addtion, CBM EO inhibited 35 mM KCI and 0.1 μM NE-indeced contractions in aorta in a dose-dependent manner. These results suggest that BM EO may have components to indece vascular relaxation.
- Administration of CBM EO lowed blood pressure in SHR
- In conclusion, CBM EO may be a useful material source for drug development to improve hypertension.
3. Testing of CBM extract effect o various risk factors relative to cardiovascular diseases
(1) Investigation on cardiovascular diseases-Linked responses in various cell types
- HUVECs: VEGF-indeced UVEC migration/proliferation or sprout outgrowth were inhibited by treatment with CBM FW. Lipopolysaccharides (LPS)-stimulated nitric oxide (NO) production and NO synthase (NOS) increase were decreased by CBM FW. Therefore, CBM FW may play a protective role in keeping vascular function.
- Cardiomycytes: CBM FW decreased TNFα-indeced apoptosis and ROS (O₂ 및 H₂O₂) generation in cardiomyocytes. Moreover, miconazole-decreased number of beating was recovered by treatment with CBM FW in cardiomyocytes. These results indicate that CBM FW may play a positive activity on responses related to cardiovascular diseased including atherosclerosis and hypertension.
- Kidney cells: Angiotensin II (Ang II) induced increased expressions of collagen type 1, fibronetin 1 and PAI-1 in kidney cells. These responses were attenuated by pretreatment with CBM FW. Moreover, CBM FW increased Ang II-enhanced expression of TGF-βin kidney cells. These results imply that CBM FW may exert protecting effect cardiovascular diseases-linked cells.
(2) Investigation on oxidative stress-associated proteins
- In VSMCs, PDGE- or Ang II-increased expressions of Ref-1, PRR and DJ-1 were attenuated by CBM FW.
- In HUVECs, CBM FW decreased TNF-enhanced expressions of Ref-1, DJ-1 and PRR.
- In cardiomyocytes, TNFα-increased expressions of Ref-1 and DJ-1 were inhibited, but not TNFα-increased expressions of PRR, by treatment with CBM FW.
- In kidney cells, Ang II-increased expressions of collagen type 1, fibronetin 1, and PAI-1 but not Ang II-increased expressions of TGF-P, were decreased by treatment with CBM FW.
- In conclusion, CBM FW may have positive activity on oxidative stress-associated proteins
4. Testing of the effects of CBM EO components on vascular disease-linked events
(1) Composition analysis and single compounds of CBM EO
- CBM EO was analyzed using gas chromatography-mass spectrometry (GS/MS) and contained total 42 compounds. Among these compounds, seventeen compounds that did not have any activity on vascular function was contained 15 monoterines and 2 sesquiterpens. For tests of their activities on vascular disease-linked events, they were purchased or isolated from CBM EO.
(2) Effects of CBM EO components in atherosclerosis-linked vascular responses -Compounds that showed more than 80% in cell viability in VSMCs concluded monopterpenes such as camphor, camphene, terpinolene, and beta-pinene. Among these compounds, camphor and terpinolene did not affect VSMC viability (about 100 %).
- Treatment with terpinolene resulted in prominent inhibition in VSMC proliferation and migration in response to PDGF. Moreover, vascular neointima formation in atherosclerosis model animal was attenuated by terpinolene compared with control.
- In conclusion, these results suggest that terpinolene may ameliorate neointima formation in atherosclerosis.
(3) Effects of CBM EO components in hypertension-linked vascular responses
- Among CBM EO components, piperitone exerted predominant inhibitory effect on 35 mM KC1 and 0.1 uM NE-induced contraction in pulmonary artery in the absence or presence of endothelium.
- Piperitone slightly decreased vascular resting tension and increased Ach-induced endothelium-dependent relaxation compared with control. Moreover, ET-l-induced vasocontraction in the presence and absence of endothelium was decreased by pretreatment with piperitone.
- Piperitone-increased vascular relaxation was slightly decreased by indomethacin but not L-NAME. Sodium nitropruside-inuced vascular relaxation did not differ between piperitone-treated or untreated groups. Moreover, piperitone inhibited the open of Ca²⁺ channel in VSMCs.
- Piperitone-treated SHR lowered its blood pressure.
- In conclusion, these results indicate that piperitone may lower blood pressure by suppressing Ca²⁺ channel in VSMCs. Therefore, piperitone may be a promising agent to positively improve hypertension.
5. Testing of CBM EO compound effect on various events relative to cardiovascular diseases
(1) Investigation on cardiovascular diseases-linked responses in VSMCs
-Among CBM EO compounds, terpinolene inhibited ketoconzaole- or Ang II-increased ROS generation and apoptosis in VSMCs. However, beta-pinene attenuated ketoconzaole- or Ang II-increased ROS generation and did not affect ketoconzaole- or Ang II-induced apoptosis. Moreover, ketoconazole-induced expression changes in DJ-1 and Bax were inhibited by treatment with terpinolen or beta-pinene. From these results, we suggest that terpinolene may be useful agent to improve abnormal conditions of cardiovscular disease-associated factors.
(2) Investigation on cardiovascular diseases-linked responses in cardiomyocytes
- Among CBM EO compounds, terpinolene or beta-pinene slightly inhibited ketoconazole- and Ang II-increased ROS generation. Ketoconazole- or Ang II-induced apoptosis was attenuated by terpinolene, but not beta-pinene. Moreover, terpinolene and beta-pinene inhibited ketoconazole-induced expression alterations in Prx3, DJ-1 and Bax. Ang II-increased D}-1 and Bax expression changes were attenuated only by treatment with terpinolene. Therefore, terpinokne may improve abnormal conditions of cardiovscular disease-related factors.
(3) Inves社gation on cardiovascular diseases-linked responses in kidney cells
- Treatment with terpinolene inhibited Ang II-increased expressions of collagen type 1 and fibronetin 1 but did not affect Ang II-increased PAI-1 and TGF-P expression. Therefore, terpinolene may exert protecting effect on fibrosis in kidney cells.
- In conclusion, terpinolene may be a useful agents to protect cardiovascular diseases-linked cells.
(4) Investigation on cardiovascular diseases-linked responses in pulmonary tissue
- Phellandrene did not affect expressions of ICAM-1, COX2, NF-kb, and Bax. However, piperitone slightly increased ICAM-1 expression and did not influence COX2, Bax, and NF-kb expressions. Therefore, piperitone may have dual activity on pulmonary tissue, although further tests will be needed for clarify the dual activity.
6. Safety test of CBM EO
(1) Acute oral toxicity test of CBM EO in rodents
- We observed rats for 14 days after oral adminstration of CBM EO and found that CBM EO did not affect clinical symptoms, body weight and feed intake in the rats. After that, there are no rat deaths and no abnormal changes in gross pathological observation after postmortem of the rats. Therefore, CBM EO was confirmed as non-toxic material in acute oral toxicity test.
(2) Acute dermal toxicity test of CBM EO in rodents
- In observation of rats for 14 days after oral adminstration of CBM EO, we found that adminstration of CBM EO did not affect clinical symptoms, body weight and feed intake in the rats. After that, there are no rat deaths and no abnormal changes in gross pathological observation after postmortem of the rats. Therefore, we concluded that CBM EO is non-toxic material in acute dermal toxicity test.
(3) Repeated-dose toxicity test of CBM EO in rodents
- Rats were subjected to repeated oral adminstration of CBM EO for 14 days (one time/day), and systemic toxicity were observed in the rats. Adminstration of CBM EO did not affect clinical symptoms, body weight and feed intake in the rats. After that, there are no rat deaths and no changes in blood test, urine chemistry values, inspection, and organ weight measurement were observed after postmortem of the rats. Non-toxic amount of CBM EO in the rats was evaluated as 5 ml/kg bw/day. Therefore, CBM EO was confirmed as non-toxic material in acute repeated-dose toxicity test.
(4) Acute inhalation toxicity test of CBM EO in rodents
Rats exposed for 4 hour with CBM EO that was diluted 100-fold (19,070 ppm) and 10-fold (190,700 ppm). Exposure to CBM EO did not affect body weight and feed intake in the rats. After that, there are no rat deaths. No abnormal changes in lung and other organs in gross pathological examination was observed after postmortem of the rats. Therefore, CBM EO was confirmed as non-toxic material in acute inhalation toxicity test.
7. Development of prototype to improve vascular disease using CBM EO
(1) On the basis of in vitro and in vivo test, we developed CBM EO-containing prototype for clinical test.
(2) Prototype for improvement of atherosclerosis was developed in the dosage of a liquid tea containing CBM FW with reference to products generally available on the market and on the basis of circulatory system specialist or internist opinions and consultancy. This dosage is known to have excellent body absorption. Thus, Mixing ratio of CBM FW to other components to promote proper body absorption was determined and prototype was custom-made by Dong Seo Pharm Well-bing Co LTD in Korea.
(3) Prototype for improvement of hypertension was developed in the dosage of spray containing CBM EO with reference to products generally available on the market and on the basis of circulatory system specialist or internist opinions and consultancy. Mixing ratio of CBM FW to other components to promote proper body absorption was determined and prototype was custom-made by Dong Seo Pharm Well-bing Co LTD in Korea.
(4) Efficiency test of prototypes
a. In vivo test of anti-atherosclerotic activity: Vascular neointima formation in atherosclerosis model animal was inhibited by treatment with CBM FW adjusted to the same conditions with prototye in a liquid tea. Therefore, this result may provide a possibility that prototype in a liquid tea may have anti-atherosclerotic activity by suppressing vascular neointima formation. However, it will be needed to test more detailed conditions for clinical application.
b. In vivo test for anti-hypertensive activity: To test the effect of prototype on hypertension, we used monoclotaline-induced pulmonary hypertension model animal and observed morphological changes of right atrium and pulmonary artery that is known as specific lesions of pulmonary hypertension. Inhalation treatment with CBM EO adjusted to the same conditions with prototype in spray ameliorated hypertrophy of right atrium and pulmonary artery wall in pulmonary hypertension model animal. These results indicate that prototype in a spray containing CBM EO may improve pulmonary hypertension. However, it will be needed to test more detailed conditions for clinical application
c. Effect on expressions of inflammation-linked proteins: Treatment with CBM EO adjusted to the same conditions with prototype attenuated ICAM-1 and NF-kb expression in VSMCs and caspase 3 and NF-kb expression in HUVECs. Moreover, ketoconazole-increased cytotoxicity and Bax expression were attenuated by treatment with CBM EO adjusted to the same conditions with prototype. Therefore, the prototype may exert protective effect against inflammation in cardiovascular disease-linked cells.
(5) Simple clinical test of CBM EO-containing prototype in human
-CBM EO-containing prototype was made with reference to products generally available on the market and on the basis of circulatory system specialist or internist opinions and consultancy. To get IRB approval for simple human clinical safety test of the prototype, we submitted an application to IRB at Konkuk University Chungju Hospital (IRB application No. KUCH 2015-09-041).
8. Development of EO from Korean native CBM
(1) Establishment of CBM cultivation conditions: We created plantation (9900 m2) for CBM cultivation in Hoseo University Practice Farm. The plantation was improved by upbuilding of drainage facilities and a well-drained soil, and also by construction of non-woven fabric/plastic mulching equipments to facilitate the weeding. In addition, we established the various conditions for composition analysis of EOs from CBM with different harvesting period and region.
(2) Establishment of extraction environment and equipments: The room for EO extraction and purification from CBM was built in Hoseo University Practice Farm. To investigate EO extraction from various Korean native plants, we secured extractors, such as two steam distillation extractor and one simple extractor, and other equipments, such as concentrator, absolute extractor, and squeezing extractor, in the room.
(3) Optimization of CBM EO isolation method: To isolate or purify EO from CBM, we used extraction methods such as steam distillation, absolute extraction, ultra-high pressure extraction and supercritical extraction, and found that steam distillation method was the most optimized extraction way.
(4) Composition analysis and efficiency investigation of CBM EO
① Components of the CBM EO were confirmed at the Korean Basic Science Institute (KBSI, Seoul, Korea) and identified by GC/MS. Results of GC/MS analysis showed that CBM EO has a total of 42 compounds. Most of these compounds belongs to monoterpenes or sesquiterpenes. Moreover, component analysis of CBM FW showed that CBM FW contained a total seven compounds.
② CBM EO had wound healing, skin regeneration, anti-oxidant, and anti-obesity activities in non-cardiovascular system.
(5) Optimization of yield, component and efficiency analysis of CBM EO
① Yield, component and efficiency analysis of EO from CBM of different flowing times
a. Component analysis
-Flowing times of CMB were divided into vegetative, pre-flowering, full-flowering states and total yield of EO from CBM in different flowing times was compared. Total yield of CBM EO was the highest in pre-flowing time and was decreased at full-flowering time. GC/MS analysis showed that CBM EO obtained at pre-flowering time had seven specific compounds including 욘-ftujone, umbellulon, and P-phellandrene. Moreover, CBM EO had high contents of monoterpenes at all flowing times, and especially increment of monoterpene contents and diminishment of sequiterpene contents were observed in CBM EO at preflowering time and full-flowering time. Several components of sesquiterpenes in CBM EO obtained at vegetative time were decreased in that at full flowering time.
b. Efficiency investigation
-CBM EO obtained at pre-flowering time had stronger migration and proliferation activity in keratinocytes or fibroblasts compared with EGF. Howerver, CMB EO obtained at vegetative or full flowering time did not affect the activities in keratinocytes and fibroblasts -CBM EO had antioxidant activity that did not differ between harvesting times.
② Yield, component and efficiency analysis of EO from CBM of different harvesting regions
a. Component analysis
- Harvesting regions of CMB were divided into northern (around top of Hangyeryeong), central (Asan), southern (around Namhae County Office). EO from CBM at pre-flowering time was extracted using distillation methods, and total yield of EO was compared between different harvesting regions. Total yield of CBM EO was the highest in the central region and was the lowest in northern region, indicating that central region (Asan) may be the most optimized point to harvest CBM. GC/MS analysis showed that CBM EO obtained in all regions had a total of 42 compounds and that CBM EO had high contents of monoterpenes at all harvesting regions. CBM EO obtained from central region had higher contents of monoterpenes and sesquiterpenes compared with other regions.
b. Efficiency investigation
-CBM EO obtained in cetral region (Asan) induced stronger migration and proliferation resopnse in fibroblasts compared with EGF. However, CMB EO obtained in other regions did not affect the activities in fibroblasts
-CBM EO exerted antioxidant activity that did not differ between all harvesting regions.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 줄 문 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• SUMMARY ... 13
• CONTENTS ... 23
• 목차 ... 24
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 및 성과목표 ... 25
• 제1절 연구개발의 목적 ... 25
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 26
• 제3절 연구개발의 범위 ... 29
• 제4절 연구 성과목표 및 대비 실적 ... 32
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 33
• 제1절 국내외 관련 기술의 현황과 문제점 ... 33
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 38
• 제1절 연구개발의 목표 및 연구개발 수행내용 ... 38
• 제2절 주요 연구수행 방법 ... 40
• 제3절 세부연구수행 방법 및 결과 ... 45
• 제 4 장 목표달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 104
• 제1절 목표의 달성도 ... 104
• 제2절 관련분야에의 기여도 ... 107
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 109
• 제1절 연구개발 성과 ... 109
• 제2절 성과 활용계획 ... 112
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 115
• 제 7 장 연구시설•장비 현황 ... 116
• 제 8 장 연구실 안전관리 이행실적 ... 117
• 제 9 장 참고문헌 ... 119
• 첨부 특허, 논문 및 시장분석 보고서 ... 140
• 끝페이지 ... 149