초록 ▼

◦ 식물 단백질 고발현 시스템을 이용하여 현장에서 재조합 서브유닛 백신이 필요한 질환에 대한 방어 항원을 식물 발현 시스템을 이용하여 발현시켜 그 생산 가능성을 조사하고자 하였다.
◦ 주관기관에서 독자적으로 개발한 5’UTR과 단백질 분리정제 tag 기술을 활용하여 돼지열병(E2), 인플루엔자(A/swine/Korea/CAN04/2005 (H3N2)), PRRS(LMY, E38), 구제역(VP1-888, 3D-743) 유전자를 이용하여 고발현 벡터를 제작하고 형질전환 애기장대를 개발하였다.
◦ 형질전환 애기장대는 T1세대

◦ 식물 단백질 고발현 시스템을 이용하여 현장에서 재조합 서브유닛 백신이 필요한 질환에 대한 방어 항원을 식물 발현 시스템을 이용하여 발현시켜 그 생산 가능성을 조사하고자 하였다.
◦ 주관기관에서 독자적으로 개발한 5’UTR과 단백질 분리정제 tag 기술을 활용하여 돼지열병(E2), 인플루엔자(A/swine/Korea/CAN04/2005 (H3N2)), PRRS(LMY, E38), 구제역(VP1-888, 3D-743) 유전자를 이용하여 고발현 벡터를 제작하고 형질전환 애기장대를 개발하였다.
◦ 형질전환 애기장대는 T1세대에서 발현 여부를 확인하고 세대를 진전시켜 T3 세대에서 homo라인을 선별하고 동일 라인에서 발현이 균일하게 되는지를 조사하여 최종 라인을 선별하였다.
◦ Swine Influenza, PRRS 2종류, 구제역 2종류의 항원 단백질은 형질전환 식물체에서 생산량이 경제적인 수준(최소 0.5% total soluble protein)에 많이 미치지 못하는 수준으로 발현되는 것을 확인하였다.
◦ 돼지 열병 E2 항원의 경우 애기장대에서 TSP 기준 0.7%를 상회하는 수준으로 발현이 되며, 식물에서 생산된 E2 항원은 항원 검출 키트에서도 강양성을 보였다.
◦ 애기장대에서 생산된 E2 항원 단백질은 cellulose라는 저렴한 resin을 이용하여 경제적인 방법으로 분리 정제가 가능하였으며, 그 효율은 30 ㎍/g (plant fresh weight) 수준으로 분리정제 가능하며 마커백신 개발에서 충분한 경제성을 가지는 효율이다.
◦ 애기장대에서 분리정제된 E2 항원 단백질을 마우스에 주사하였을 때, 항체 생성율이 높고 이는 돼지 열병 항체 검사에 사용되고 있는 항체 검사 키트에서 1000배 이상의 희석배율에서도 강한 양성을 나타내는 수준이다.
◦ 식물발현 E2로 면역된 마우스 혈청을 농림축산검역본부에서 바이러스 중화항체가를 조사하였을때, 사용한 adjuvant에 따라 항체가가 다른 결과를 얻었지만 최고 중화항체가는 항원 0.6 ㎍ 주사한 경우 4096을 상회하는 높은 항체가를 얻었다.
◦ 추가 연구를 통하여 식물발현 E2 단백질의 돼지에서의 항체 형성능, 공격접종 등의 실험으로 마커 백신으로서의 개발 가능성을 심도있게 연구할 필요가 있다.

Abstract ▼

◦ The aim of this project was to validate the possibility of plant expression system as a production tool for recombinant subunit animal vaccines.
◦ Using the proprietary technology(5’UTR and protein hybrid tag) owned by BioApp Inc., antigens from CSFV(Classical Swine Fever Virus), SIV(Swine Infl

◦ The aim of this project was to validate the possibility of plant expression system as a production tool for recombinant subunit animal vaccines.
◦ Using the proprietary technology(5’UTR and protein hybrid tag) owned by BioApp Inc., antigens from CSFV(Classical Swine Fever Virus), SIV(Swine Influenza Virus), PRRS(Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) and FMD(Foot and Mouth Disease) were tested.
◦ Transgenic Arabidopsis expressing E2(CSFV), H3N2(SIV), LMY/E38(PRRS) and VP1/3D(FMD), were generated and analyzed of protein of desire by western blotting at T1 generation.
◦ All of transgenic Arabidopsis were proceeded to T3 homo-single insertion lines.
◦ Expression level of H3N2(SIV), LMY/E38(PRRS) and VP1/3D(FMD) were much below the break-even point of commercialization, which is 0.5 % of TSP(total soluble protein) so called.
◦ In the case of E2(CSFV), the expression level was way over the 0.7%, moreover plant-made E2 showed extremely strong positive signal on the commercialized antigen detection ELISA kit.
◦ E2 protein were purified by cellulose via cost-effective method at 30 ㎍/g of 3-week grown transgenic Arabidopsis.
◦ The E2 antigen from plant did generate the strong specific antibody bothe against own antigen and CSFV(commercial antibody detection ELISA kit).
◦ The serum from pmE2 immunized mouse were sent to QIA and analysed for VNT(virus neutralization test) revealing the VNT value of 4096 at 0.6 ㎍ injection.
◦ It seems to be essential to further investigate the immune response in pigs and protection effect by virus challenge experiment forward plant-derived CSFV recombinant vaccine.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 총괄 연구과제 요약 ... 2
• 연구결과보고서 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 7
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 8
• 1.3 국내․외 기술개발 현황 ... 8
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 9
• 2.1 연구 개발 내용 ... 9
• 2.2 연구 개발 방법 ... 10
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 13
• 3.1 돼지열병 방어 항원 생산 시스템 구축 ... 13
• 3.2 인플루엔자 방어 항원 생산 시스템 구축 ... 20
• 3.3 PRRS 방어 항원 생산 시스템 구축 ... 22
• 3.4 구제역 방어 항원 생산 시스템 구축 ... 26
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 30
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 30
• 5.1 활용성과 ... 30
• 5.2 활용계획 ... 31
• 제6장 첨부서류 ... 32
• 끝페이지 ... 32