초록 ▼

1. 연구개발사업의 목적
자연살해세포(NK cell)은 암세포의 발생, 증식, 전이를 억제하고 암의 재발에 가장 중요한 암 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있음. 또한 다른 면역세포와 달리 면역거부 반응이 극히 적고 안전하여 항암면역치료제로 개발 시 큰 장점을 가짐. 하지만 NK cell의 활성화 기전은 다른 면역세포에 비해 미비하여 아직까지 NK cell을 이용한 치료법은 많은 한계를 가짐. 따라서 본 연구진은 NK cell의 활성이 억제되는 기전에 초점을 맞추어 이의 제어를 통해 NK cell 활성 증진을 위한 신 개념의

1. 연구개발사업의 목적
자연살해세포(NK cell)은 암세포의 발생, 증식, 전이를 억제하고 암의 재발에 가장 중요한 암 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있음. 또한 다른 면역세포와 달리 면역거부 반응이 극히 적고 안전하여 항암면역치료제로 개발 시 큰 장점을 가짐. 하지만 NK cell의 활성화 기전은 다른 면역세포에 비해 미비하여 아직까지 NK cell을 이용한 치료법은 많은 한계를 가짐. 따라서 본 연구진은 NK cell의 활성이 억제되는 기전에 초점을 맞추어 이의 제어를 통해 NK cell 활성 증진을 위한 신 개념의 원천기술을 확보하고자 함.

2. 연구방법
(1) c-Cbl 제어를 통한 NK cell 항암활성 연구
- NK cell에서 c-Cbl의 발현을 억제하여 조절 받는 NK cell 활성화 경로를 분석함.
- c-Cbl 발현 억제에 영향을 받는 NK 수용체에 의한 NK cell 활성 변화를 분석함.
- c-Cbl 발현이 억제된 NK cell의 다양한 암세포에 대한 항암 활성을 분석함.
(2) NK cell 활성억제 신규 단백질의 제어를 통한 항암활성 연구
- Antibody array를 이용하여 NK cell 활성조절 신규 인산화 단백질을 발굴함.
- 발굴된 신규 NK cell 활성 억제 단백질의 발현을 조절하여 NK cell 활성 변화를 분석함.
- 발굴된 신규 단백질의 저해제에 의한 NK cell 활성 변화를 분석함.
(3) NK cell 활성억제 물질 capsaicin의 작용기전 연구
- Capsaicin의 NK cell 항암 활성 저해 효과를 분석함.
- NK cell에서 capsaicin 수용체인 TRPV1의 발현을 분석함.
- NK cell 활성 조절 효과의 TRPV1 의존성을 분석함.

3. 연구결과
(1) c-Cbl 제어를 통한 NK cell 항암활성 연구
- c-Cbl 제거에 의해 항암활성에 중요한 다양한 NK 수용체(NKG2D, 2B4, DNAM-1)에 의한 calcium flux가 증가됨을 확인함. 또한 c-Cbl 제거에 의해 증가된 calcium flux는 SLP-76 제거에 의해 억제됨. 따라서 SLP-76는 c-Cbl에 의해 조절 받는 표적 단백질임을 확인함.
- c-Cbl 제거에 의해 다양한 NK 수용체 각각 및 그 조합에 의한 세포살해활성 및 염증인자(IFN-γ, MIP-1α) 생성이 증가함을 확인함.
- c-Cbl 제거에 의해 여러 표적세포(K562, 721.221, P815)에 대한 NK cell의 세포살해활성 (CD107a)이 증가함을 확인함.
- c-Cbl 제거에 의해 염증인자 생성에 핵심적인 NF-κB 전사인자의 활성(p-p65, pIκBα등)이 증가함을 확인함. 따라서 NF-κB 활성이 c-Cbl에 의해 조절 받음을 확인함.
- c-Cbl 제거에 의해 NF-κB 전사활성이 증가함을 제작된 NK reporter cell line을 활용하여 규명함.
- c-Cbl 제거에 의해 활성이 증가된 NK cell은 NK cell 활성억제 물질인 capsaicin에도 저항성을 가져 cytotoxicity를 유지함.
(2) NK cell 활성억제 신규 단백질 제어를 통한 항암활성 연구
- NK cell 활성화 조건에서 인산화 단백질을 antibody array로 비교 분석하고 검증한 결과 두 종류의 단백질(AMPK, GSK-3)이 NK cell 활성화와 연관되게 인산화 됨을 확인함.
- AMPK의 경우 NK cell 활성 영향이 적었으며 GSK-3 활성을 억제한 결과 NK cell 염증인자(IFN-γ, MIP-1α) 생성 및 세포살해활성이 증가하여 NK cell 활성화에 GSK-3의 활성억제가 필요함을 확인함.
- GSK-3의 인산화 경로를 분석하기 위해 chemical inhibitor를 사용한 결과 PI3K/Akt, Erk 경로가 GSK-3 인산화에 관여함을 확인함.
- GSK-3의 두가지 isoform(GSK-3α 또는 GSK-3β)를 각각 knockdown하였을 때, NK cell의 활성이 GSK-3β 특이적으로 조절됨을 확인함.
- GSK-3β 억제에 의한 NK cell 활성증가는 calcium flux, NFAT1, NF-κB 활성증가에 기인함을 규명함.
- GSK-3β의 다양한 mutant(wild-type, kinase dead, constitutive active)를 과발현한 실험 결과 kinase-dead from에 NK cell 활성이 증가되어 GSK-3β kinase activity가 NK cell 활성조절에 중요함을 규명함.
- GSK-3β 억제에 의해 NK cell line 뿐 아니라 primary NK cell의 다양한 표적세포에 대한 항암활성도 공통적으로 증가됨을 확인하여 GSK-3β가 NK cell 활성억제에 관여하는 신규 단백질임을 규명함.
(3) NK cell 활성억제 물질 capsaicin의 작용기전 연구
- NK cell의 세포살해활성이 capsaicin에 의해 감소하며 capsaicin이 NK cell에 직접적으로 작용함을 규명함.
- NK cell의 위암세포(AGS, MKN45, Hs746T)에 대한 세포살해활성 역시 capsaicin에 의해 감소함.
- NK cell이 capsaicin 수용체로 알려진 TRPV1을 발현하고 있으며, capsaicin에 반응하여 calcium flux가 증가함을 확인함.
- TRPV1 저해제를 이용하여 capsaicin에 의한 NK cell 활성저해 효과는 TRPV1에 의존적이지 않음을 확인함.
- TRPV1 knockout mice를 이용하여 capsaicin에 의한 NK cell 활성저해 효과가 대부분 TRPV1에 비의존적임을 최종 규명함.
- Capsaicin에 의한 NK cell 활성결함은 Calcium flux 변화에 기인함을 규명함.

4. 기대효과
인체 내 항암면역반응에 핵심적인 NK cell의 활성억제 기전이 규명되고 새로운 활성억제 단백질이 발굴되어 이의 제어를 통해 임상적 응용에 이르는 새로운 항암세포치료 원천기술이 개발될 가능성이 있음. 또한 본 연구결과는 암 외에도 NK cell이 핵심적인 역할을 하는 감염질환, 골수·조직이식, 염증질환, 자가면역질환 같은 다른 난치성질환의 치료법 개발에도 응용될 수 있을 것으로 기대됨.

Abstract ▼

1. Research purpose
Natural killer cells (NK cells) are innate lymphocytes that play a crucial role in the prevention, proliferation and metastasis of cancer cells. They have gained growing attention and are now being considered as promising therapeutic tools for cancer therapy owing to their int

1. Research purpose
Natural killer cells (NK cells) are innate lymphocytes that play a crucial role in the prevention, proliferation and metastasis of cancer cells. They have gained growing attention and are now being considered as promising therapeutic tools for cancer therapy owing to their intrinsic ability to kill cancer cells including cancer stem cells contributing to cancer recurrence, while sparing normal healthy cells. Despite a significant progress made in the role of NK cells as a pivotal sentinel in cancer surveillance, the molecular mechanism that regulate NK cell responses remain unclear, which restricts the use of NK cells as a therapeutic measure. Therefore, we aimed to develop an innovative technology for boosting NK cell effector functions for by targeting and modulating signaling proteins that limit the the activation of NK cells.

2. Research approach
(1) Study of NK cell anti-tumor activity by modulating c-Cbl
- Analysis of NK cell signaling pathways affected by depletion of c-Cbl
- Analysis of NK cell activation through activating receptors affected by c-Cbl depletion
- Analysis of susceptibility of diverse tumor cells to NK cells with c-Cbl depletion
(2) Study of NK cell anti-tumor activity by modulating new screened protein that limits NK cell activation
- Screening of new phospho-proteins involved in NK cell activation using antibody array
- Analysis of NK cell activation by modulating new signaling protein screened
- Analysis of NK cell activation by small molecule drugs that target screened protein
(3) Study of action mechanism of capsaicin that limit NK cell activation
- Analysis of NK cell activation that is blocked by capsaicin treatment
- Analysis of the expression of TRPV1, a cognate receptor for capsaicin, in NK cells
- Analysis of the involvement of TRPV1 in the suppression of NK cells by capsaicin

3. Results
(1) Study of NK cell anti-tumor activity by modulating c-Cbl
- c-Cbl depletion upregulates calcium flux triggered by NK activating receptors(NKG2D, 2b4, DNAM-1) important for tumor surveillance. Moreover, such an increase in calcium flux is inhibited by combined depletion of SLP-76, thus indicating SLP-76 as a target protein of c-Cbl
- c-Cbl depletion upregulates NK cell effector functions(cytotoxicity and cytokine production) through diverse NK activating receptors
- c-Cbl depletion potentiates NK cell cytolytic activity(CD107a) against various tumor cells(K562, 721.221, P815)
- c-Cbl depletion augments activation of NF-κB(p-p65, pIκBα, etc), a key transcription factor for cytokine production, thus indicating NF-κB as a crucial target of c-Cbl
- We confirmed NF-κB activation by c-Cbl depletion by constructing NF-κB reporter NK cell line
- c-Cbl depletion confer on NK cells a resistance to inhibitory effect of capsaicin
(2) Study of NK cell anti-tumor activity by modulating new screened protein that limits NK cell activation
- Using antibody array, we screened two phospho-proteins(AMPK, GSK-3) that correlate with NK cell activation
- Among them, GSK-3 but not AMPK is found to associate with NK cell activation using specific small molecul inhibitors
- Using chemical inhibitors that target selective signaling pathways, we identified the requirement of PI3K/Akt and Erk for an inhibitory phosphorylation of GSK-3
- Using siRNAs that target specific isoform of GSK-3(GSK-3α or GSK-3β), we identified the involvement of GSK-3β but not GSK-3α in NK cell activation - GSK-3β depletion augments calcium flux and activation of NFAT1 and NF-κB in NK cells
- With the overexpression of various mutants(wild-type, kinase-dead, constitutive active), we identified that kinase activity of GSK-3β is required for modulation of NK cell activity
- We confirmed the functional significance of GSK-3β in suppressing NK cell effector functions against diverse target cells in both primary NK cells and NK cell line
(3) Study of action mechanism of capsaicin that limit NK cell activation
- Capsaicin inhibits NK cell effector functions and it has a direct effect on NK cells
- Capsaicin decreases the susceptibility of stomach cancer cells(AGS, MKN45, Hs746T) to NK cells
- NK cells express functional TRPV1 receptor, a cognate receptor for capsaicin, and respond to capsaicin for eliciting calcium flux
- Using TRPV1 antagonists, we identified that the inhibitory effect of capsaicin on NK cells is largely independent of TRPV1
- Using TRPV1-knockout mouse, we confirmed that the inhibitory effect of capsaicin on NK cells is largely independent of TRPV1
- We found that capsaicin blocks NK cell activation through modulation of calcium influx

4. Expected effect
Through our study, we identified a crucial control mechanism that inhibits NK cell activation. Moreover, it is expected to develop a new cancer immunotherapy based on a modulation of NK cell effector functions. Finally, besides cancer, our study results would be applicable to various human diseases(infectious disease, transplantation, inflammatory disease, autoimmunity, etc) related to NK cell activation.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 1. 연구배경 및 필요성 ... 8
• 2. 연구개발 목표 및 내용 ... 11
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 13
• 〇 연구범위 및 연구수행 방법 ... 13
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 18
• 〇 연구수행 내용 및 결과 ... 18
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 44
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 45
• (1) 연구성과 총괄 ... 45
• (2) 연구성과 상세내역 ... 46
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 49
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 50
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 50
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 50
• 7. 참고문헌 ... 51
• 8. 첨부서류 ... 53
• 끝페이지 ... 59