초록 ▼

Ⅲ. 세부 과제별 연구개발의 내용 및 결과
1. 제 1세부 과제
제 1세부 연구팀은 해충군 관리 현황 조사, 저항성 진단키트 개발 및 응용 그리고 저항성 해충군 방제 체계 개선 연구를 수행하였다.
시설장미에서 점박이응애와 꽃노랑총채벌레 관리 실태를 조사한 결과, 천적을 활용한 농가는 전체 조사 농가 중에서 두개 농가로 대부분 화학적 방제에 의존하고 있었다. 장미 농가의 최대 살포 횟수는 56회로서 5-6월에 방제 빈도가 증가하였다. 점박이응애 방제를 위한 살비제 사용 빈도 순서는 사이에노피라펜, 클로르페나피르, 비페

Ⅲ. 세부 과제별 연구개발의 내용 및 결과
1. 제 1세부 과제
제 1세부 연구팀은 해충군 관리 현황 조사, 저항성 진단키트 개발 및 응용 그리고 저항성 해충군 방제 체계 개선 연구를 수행하였다.
시설장미에서 점박이응애와 꽃노랑총채벌레 관리 실태를 조사한 결과, 천적을 활용한 농가는 전체 조사 농가 중에서 두개 농가로 대부분 화학적 방제에 의존하고 있었다. 장미 농가의 최대 살포 횟수는 56회로서 5-6월에 방제 빈도가 증가하였다. 점박이응애 방제를 위한 살비제 사용 빈도 순서는 사이에노피라펜, 클로르페나피르, 비페나제이트 순이였다. 꽃노랑총채벌레 방제용 살충제 사용 빈도는 에마멕틴벤조에이트, 클로치아니틴, 스피네토람 순으로 나타났다.
효과적이고 신속한 저항성 진단을 위해 잔류접촉법을 기반으로 한 간이진단기법을 개발하였다. 잔류접촉법은 감수성 계통의 100% 치사를 유도하는 살비제를 바이엘에 코팅 후 야외 집단을 접종하여 8시간 안에 사충율을 조사하여 저항성 여부를 평가하는 기법이다. 대상 약제로는 현재까지 IRAC에 등록된 살비제 14개 그룹에서 18종의 대표 약제를 선발하였다. 독성 지표(toxicity paramater)를 통해 진단농도를 산출하였고, 감수성과 저항성 수준을 구별할 수 있는 진단농도는 LC₉₀의 2배 농도로 설정하였다. 그 결과, 성장 발육 저해와 관련된 살비제 6종을 제외하고 12종의 약제가 잔류접촉법에 활용이 가능한 것으로 나타났다. 예비 실험으로, 실험실에서 유지중인 표준계통 7계통과 2013년 6개의 채집 계통을 대상으로 독성 평가를 수행하였다. 김제 집단을 제외하고 대부분의 집단이 높은 수준의 복합저항성을 지닌 것으로 나타났다. 그리고 2015년에 채집한 46개 집단에 적용한 결과, 페노치오카브와 클로르페나피르를 제외하고 높은 복합 저항성을 지닌 것으로 나타났다. 이 가운데 싸이플루메토펜은 특정 농가에서 효과가 있는 것으로 나타나 진단키트 적용 후 가용할 것으로 사료된다. 잔류접촉법에서 산출된 진단력은 스프레이법을 통해 나타난 결과와 높은 상관성이 있어 (R=0.889) 대상 결과의 신뢰성이 높다.
꽃노랑총채벌레의 살충제 저항성 진단을 위해 잔류접촉법을 기반으로 한 RCVpW 기법을 개발하였다. 해당 방법은 생존력을 높이기 위해 유리병안에 물 1ul를 넣어 무처리 생존력을 증대 시킨 기법이다. 전체 7종 살충제(omethoate, chlorfenapyr, imidacloprid, acrinathrin, spinosad, emamectin benzoate and thiamethoxam)중에서 omethoate와 imidacloprid를 제외하고 진단 농도(0.03에서 0.42 μg^-1cm²)의 산출이 가능하였다. 2종의 살충제는 고농도에서 바이엘의 벽면에 점액을 형성되어 적용하는데 한계가 있었다. 5종의 살충제를 대상으로 RDA 계통을 100% 치사할 수 있는 진단농도를 선정하고 5개 야외 집단을 대상으로 저항성 스크리닝을 수행하였다. 표준 집단은 감수성을 나타내는 반면에 야외 집단은 전체적으로 50% 미만의 독성을 보였다. 이 중에서 chlorfenapyr가 독성이 우수한 것으로 보였다. 해당 기법은 현장에서 꽃노랑총채벌레의 약제 저항성 모니터링을 가능하게 할 것으로 사료된다.
약제 방제 체계 설정을 위해 점박이응애 지역 집단의 약제별 정보를 기반으로 통합저항성 지수를 산출하였다. 각 약제별 사충율에 등급별 가중치를 부여한 다음 곱한 후 로그 전환한 다음 통합 값에 위험도 등급을 부여했으며, 지역별/등급별 화학방제 가능 여부를 제시하였다. 그 결과 장미 재배지역 83%가 저항성 수준이 높음으로 나타나 신규약제를 의존하거나 화학적방 제이외의 기법 도입이 시급한 것으로 나타났다. 화학적 방제가 가능한 곳은 15% 농가로 이중에는 천적기반 방제 농가가 포함되어 있었다.

2. 제 2세부 과제
상기 연구팀에서는 꽃노랑총채벌레의 약제 저항성 기작연구 및 진단키트 개발에 초점을 맞추어서 연구를 수행하였다. 약제 저항성 기작 규명 연구로서, 살충제에 대한 주요 약제 작용점상에 돌연변이 존재여부를 확인하였다. 그 결과 유기인계 약제 저항성과 연관있는 AChE 유전자에 존재하는 3종류(A201S, S205A, G441A) 돌연변이와 피레스로이드 저항성과 연관있는 VSSC 상의 2종류(T929I와 L1014F) 돌연변이를 확인하였다. 스피노사드 약제 저항성과 연관있는 nAChR상의 G275E 돌연변이는 발견되지 않았다. 이 중에서 분자기반 저항성 진단 기법을 구축하기 위한 정량적 염기서열 기법을 피레스로이드 저항성 형질빈도 진단을 위해 구축하였다. 예측 회귀식을 산출하였고, 5개 집단을 대상으로 조사한 결과 3개 집단에서 피레스로이드 저항성 관련 돌연변이를 지닌 것을 확인되었다. 저항성 기작 연구로서 감수성 계통과 복합저항성 계통인 RDAHC 계통을 대상으로 전사체 분석을 수행하였다. 우선 기존의 밝혀진 유전체를 대상으로 annotation을 수행하여 DB를 확보하였다. RNA-seq 분석을 통해 전사체 분석 결과, Cuticular protein이 50%이상 차지하는 것으로 나타나 저항성에 관여하는 것으로 추정이 되었다. 유전체 DB에서 저항성 관련 해독효소를 annotation한 다음 각 유전자별 과발현 유전자를 파악하였다. 그 결과 230여개의 해독효소 중에서 과발현 유전자로서 CYP3개, GST 2개, UGT 1개, ABC 1개로서 전체 12개 과발현 해독효소를 발굴하였으며, 추후 저항성 진단용 마커로 활용하고자 한다. 살충제 저항성 진단 키트는 앞서 1세부 공동연구 내용으로 소개되었다.

3. 제 1협동 과제
1협동 연구팀은 점박이응애를 대상으로 분자 마커 기반 저항성 진단 기법 개발, 아치사량 반응 유전자 발굴, 지역 집단 유전형 분석 그리고 공생미생물의 저항성 관여 여부를 규명하는데 초점을 맞추어 연구를 수행하였다. 지금까지 5종의 살비제에 관여하는 12종의 돌연변이가 보고되었으며, 개체군 수준에서 저항성을 측정할 수 있는 정량적 염기서열측정법을 개발하였다. 해당 돌연변이의 예측 회귀식을 산출하고, 지역 계통의 돌연변이의 형질빈도를 조사하였다. 그 결과 계통 특이적 돌연변이가 발견되었고 장미에서 채집한 집단에서 저항성에 관여하는 5종의 돌연변이가 발견되었다. 저항성 관련 돌연변이가 잔류접촉법에서 나타난 저항성 수준의 반영여부를 상관관계 분석을 통해 증명해 보았는데, Tuace과 TuCytb의 P262T 돌연변이를 제외하고 나머지 10종의 돌연변이는 0.583~0.970의 상관관계가 도출되었다. 즉 해당 약제에 대한 돌연변이 형질빈도는 생물검정을 대체해서 저항성 측정에 활용이 가능한 것으로 나타났다. 분자 진단 결과, 지역 집단은 잔류접촉법에서 보여준 결과와 마찬가지로 복합 저항성 패턴을 보였다. 유전형 분석 결과 국내 지역 집단은 green-type과 red-type으로 구분이 되는데, red-type 집단은 스페인과 이스라엘의 유전형과 가장 근접한 것으로 나타나 국내에 유입된 것으로 추정된다. 점박이응애 약제 적응과 관련된 유전자 스크리닝을 위해 아치사량 반응 유전자 마커를 전사체 분석을 통해 연구하였다. 과발현 유전자 중에 cuticular protein이 40%이상 차지하고 있었다. 해당 유전자 그룹에 대한 기능 분석이 필요하다. 공생미생물이 저항성에 관여하는지 일차적으로 9개 계통을 대상으로 metagenome 분석을 수행하였다. 전체적으로 64-129종의 미생물이 동정되었는데, 속 수준에서 종수를 조사결과, Wolbachia와 Rickettsia가 우점하는 것으로 나타났다. 이 중에서 약제 저항성 지수와 연관이 있는 것은 Rickettsia였으며, 직접적인 연관을 규명하는 연구가 필요하다.

Abstract ▼

Two-spotted spider mite (Tetranychus urticae) and western-flower thrips (Franklinella occidentalis) are major pests causing significant damage by direct sucking or transmitting plant viral diseases. Two pests have been mainly controled by the application of synthetic pesticides, but the control effe

Two-spotted spider mite (Tetranychus urticae) and western-flower thrips (Franklinella occidentalis) are major pests causing significant damage by direct sucking or transmitting plant viral diseases. Two pests have been mainly controled by the application of synthetic pesticides, but the control effects were reduced by the emergence of pesticide-resistant populations. For the effective pesticide resistance management, both the elucidation of resistance mechanisms and the development of resistance detection system should be carried out in parallel. In this study, we have developed a rapid diagnosis system that can detect the phenotypic and genotypic resistance traits and investigated resistance mechanisms based on transcriptome analysis to search for molecular resistance markers.
We conduced a survey for pesticide management status in rose cultivation areas, developed and tested a resistance diagnostic kit, and improved the resistance management system for T. urticae and F. occidentalis. In the survey of management status, only two out of 59 farms used natural enemy. The highest pesticide application frequency was 56 times, which were mainly distributed in May and June. The most frequently used active ingredients of acaricide were in the order of cyenopyrafen, chlorfenapyr and bifenazate. In the case of insecticide, they were in the order of emmamectin benzoate, clothianidin and spinetoram. For the development and application of rapid resistance diagnostic kit, the residual contact vial bioassay (RCV) was employed. In the RCV method, collected field insects were transferred to glass vials that had been coated with diagnostic doses killing 100% of susceptible population within 8 h and their mortality was measured. A total of 12 acaricides were chosen as applicable ingredients among 18 acaricides categorized into the 14 representative groups designated by IRAC. Diagnostic concentrations were set as 2-fold concentrations of LC₉₀ that can discriminate susceptible and resistance level after calculation of toxicity parameters. Six acaricides showing slow toxic action were excluded. In the survey of resistance level, strikingly, most field populations collected in 2013 exhibited the multiple resistance except Gimje population. Although high levels of multiple resistance were also shown in the 46 populations collected in 2015, both fenothicarb and chlorfenapyr among tested acaricides exhibited a moderate level of control efficacy. Moreover, diagnostic tests in some farms revealed that cyflumetofen can be used further. The mortality resulted from RCV showed a high correlation (R= 0.889) with that from the spray method, in which recommendation concentrations of commercial product were used, suggesting the high reliability of RCV method in resistance monitoring. Based on the RCV scheme, diagnostic doses for seven insecticides that are widely used for F. occidentalis control were determined at 8 h post-treatment using a susceptible RDA strain. The diagnostic doses for five insecticides (chlorfenapyr, acrinathrin, spinosad, emamectin benzoate and thiamethoxam) were in the range of 0.03 to 0.42 μg^-1cm² and were readily applicable for the detection of resistance levels. In the case of the remaining two insecticides (omethoate and imidacloprid), however, the estimated diagnostic doses were too high (3.28 and 12.4 μg^-1cm²), respectively) to form a viscous film over the inner wall of the treated vial, thereby limiting their use for resistance detection. Thus, the performance of RCV in detecting resistance to the five insecticides was evaluated for five local populations of F. occidentalis. The RDA strain exhibited 100% mortality to all insecticides tested, whereas field populations collected from horticultural glass houses generally showed remarkably reduced mortality (<50%) to acrinathrin, thiamethoxam, spinosad, and emamectin benzoate, suggesting varying degrees of resistance to these insecticides. Chlorfenapyr resulted in relatively higher mortalities, indicating that it is a better option compared with the other insecticides for the control of these field populations. For the improvement of resistance management system, integrated phenotypic resistance index were determined. Briefly, the weight value were assigned on specific range of mortality and multiplied for each mortality. And then, the value was transformed to log and utilized for management criteria. The results showed that 83% of populations were in an emergent need to adopt for new types of acaricides or alternative management methods. Less than 15% were only good for chemical control, including two farms managed with natural enemies.
We also investigated resistance mechanisms and developed resistance diagnostic methods for F. occidentalis. As a molecular resistance mechanism study, point mutations were screened in major insecticide target genes. The three point mutations (A201S, S205A, G441A) and two mutations (T929I and L1014F) were found in the type-1 acetylcholinesterase and voltage sensitive sodium channel genes. The G275E mutation in nicotinic acetylcholine receptor gene was not found in this study. Among several molecular giagnostic methods, the quantitative sequencing (QS) was established for pyrethroid resistance detection in population levels. QS revealed that three populations were identified as possessing the pyrethroid resistant-trait. As a resistance mechanism study, transcriptome analysis was performed using RDA and RDAHC strains. Gene annotation and RNA-seq analysis revealed that several cuticular proteins were involved in the resistance. In addition, detoxification enzymes were newly annotated from the genome and the expression levels were determined. Among 230 detoxification enzymes identified, 12 detoxification genes were determined to be overexpressed (3 CYPs, 2 GSTs, 1 UGT, and 1 ABC). These detoxification genes can be further utilized as resistance diagnostic markers with molecular diagnostic techniques.
Finally, we determined resistance allele frequency, identified the genes responding to sub-lethal doses of insecticides and analyzed the correlation between the symbiotic microorganism compositions and resistance phenotype of T. urticae. QS was established for the determination of 12 mutations associated with five acaricide resistance on a population level. The resistance allele frequency exhibited moderate correlations as 0.583~0.970 except two mutations on acetylcholinesterase and P262T on cytochrome b, suggesting that molecular diagnostics is possible to replace the value of resistance level by bioassay. Almost local population exhibited the multiple resistance likewise the phenotypic-resistant character determined from RCV. In the haplotype analysis, red and green-type mite were found in rose cultivation areas. The red mites exhibited high identity with several European population, indicating that the possibility of invasion from foreign countries. On the study of sublethal responsible genes, 40% of overexpressed gene were identified as cuticular proteins by the transcriptome analysis. In the metagenome analysis for symbiotic microorganisms, 64-129 microorganisms were identified. The genus Wolbachia and Rickettsia were dominant in T. urticae. When compared with resistance level, Richettsia might be considered as possible factor for the association of phenotypic resistance on green-type T. urticae.
In summary, the resistance detection system based on RCV was established to determine the local population resistance level for T. urticae and F. occidentalis. This resistance detection system can help farmers to choose appropriate pesticides on a reasonable basis to enhance the efficacy of pesticides. Especially molecular diagnostic techniques such as QS is useful to measure the resistance level at the same time by reducing costs in the population level. It may provide practical information for nation-wide management of pesticide resistance by replacing the conventional bioassay methods.