초록 ▼

모싯잎송편은 우리의 옛 전통을 계승하는 대표 식품으로 국내시장은 물론 해외시장에서도 소비가 지속적으로 증가하고 있다. 이에 부응하여 소비자로부터 안전한 식품으로 신뢰성을 구축하기 위해서는 안정적인 원료 확보 및 원료 표준화가 요구되고 있으며, 항산화, 항균 등 기능성 물질을 규명함으로써 국민 건강복지 향상에 기여하는 식품으로 자리 잡고자 한다. 따라서 본 연구에서는 모싯잎 특유의 고유한 기능성물질 탐색과 효능을 검정하며, 모시 유전자원의 효율적 관리 및 식품용 모시 품종의 규격화를 위해 품종 판별용 분자마커를 개발하고, 떡 가공식품

모싯잎송편은 우리의 옛 전통을 계승하는 대표 식품으로 국내시장은 물론 해외시장에서도 소비가 지속적으로 증가하고 있다. 이에 부응하여 소비자로부터 안전한 식품으로 신뢰성을 구축하기 위해서는 안정적인 원료 확보 및 원료 표준화가 요구되고 있으며, 항산화, 항균 등 기능성 물질을 규명함으로써 국민 건강복지 향상에 기여하는 식품으로 자리 잡고자 한다. 따라서 본 연구에서는 모싯잎 특유의 고유한 기능성물질 탐색과 효능을 검정하며, 모시 유전자원의 효율적 관리 및 식품용 모시 품종의 규격화를 위해 품종 판별용 분자마커를 개발하고, 떡 가공식품 원료로 적합한 우량품종을 선발하고자 하였고 그 결과는 다음과 같다.
1. 우량품종 선발 신품종 보호출원
모시 품종연구에 관한 자료도 많지 않으나 그나마도 섬유생산이 목적인 연구 위주여서 식용모시 특성조사 기준 마련이 시급하였다. 이에 국립식량과학원, 국립농업과학원, 한국연구재단소속 전문가들을 초청하여 수차례 자문을 받아 식용 모시 특성조사 기준을 자체적으로 마련하였고, 이를 바탕으로 국립종자원에 UPOV 기준과의 부합성 여부를 검토 받았으며(2013.12.) 연구 수행 과정 및 협의회를 통해 꾸준히 재정비하여 최종적으로 식용 모시 특성조사 기준을 마련하였다. 기존에 섬유용으로는 섬유질 중심의 줄기 위주 수량성을 검토하였으나 식용으로는 잎을 이용하기 때문에 잎의 크기 및 색 중심의 특성과 함께 엽의 수량성을 부여하였다. 영광군농업기술센터에서 보유하고 있는 국가생명자원으로 등록되어 있는 90점의 모시 유전자원을 공시재료로 하여 영광군농업기술센터에서는 생엽수량을 포함한 생육적 특성을 조사하고, 중앙대에서는 항산화, 항균, 항염증, 항당뇨 활성 등 기능성 물질을 분석, (주)바이오메딕에서는 각 자원별 순도 분석을 맡아 수행하였으며, 각 기관별 결과 자료를 종합하여 1차년도에 9개 자원을 선발하였다. 2차년도에는 (주)바이오메딕연구소에서 실시한 순도 분석 결과 9개 자원 중 분리가 되는 종에 대하여 순계분리 과정을 거쳐 순도를 유지시키는 한편, 1년차에 선발된 9개 자원을 대상으로 농업적으로 유용한 고유특성과 가변특성을 조사하고, 모싯잎의 가공적성을 보기 위하여 삶기 전과 삶은 후의 무게 및 색도를 측정하였으며 삶은 모싯잎의 식이섬유 함량을 분석하여 그 결과를 바탕으로 최종적으로 우량하다고 판단되는 1품종을 선발하였다. 3차년도에는 섬유용으로 등록된 유일한 모시 품종인 ‘서방’을 대비품종으로 하여 특성검정 시험 및 시제품을 제작하여 가능성을 검토하였고, 명칭 부여 협의회를 거친 후 2015년 11월 5일 국립종자원에‘옥당’이라는 명칭으로 신품종 보호 출원하였다.
2. 모싯잎 특유의 고유한 기능성물질 탐색과 효능 검정
1차년도에는 모시품종의 in vitro 유용성 및 약리활성 탐색을 위하여 90점의 모싯잎을 가지고 항산화 활성 탐색[1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 측정, Hydroxy radical (·OH) 소거능 측정], 항균 활성 탐색(디스크 확산법), 항암 활성 탐색(MTT assay), 항염증 활성탐색(NO 생성 억제 측정, MTT assay)과 항당뇨 활성 탐색(Aldose Reductase 억제활성 측정)을 진행하였다. 그 결과 DPPH 소거활성 능력을 보면 총 90점의 추출물 중에서 34점이 80%이상의 소거율을 나타내었으며, 그 중 Bn-13, Bn-82는 각각 95.17%, 90.71%로 가장 높은 소거능력을 보였다. ·OH의 소거능을 측정한 결과, Bn-3을 제외한 모든 추출물에서 80% 이상의·OH 소거 효과를 보였으며, 81점이 90% 이상을 나타냈고 이중 7종(Bn-37, -42, -65, -71, -73,-78, -80)이 99% 이상으로 ·OH에 대한 독성 제거 효과가 매우 우수함을 보였다. 따라서, Boehmeria nivea는 in vitro에서 free radical 소거에 의한 항산화 효과가 뛰어난 것으로 사료된다. 그람 음성균 중 하나인 Escherichia coli에 대한 B. nivea의 생육 억제환을 살펴본 결과11점(Bn-6, -10, -15, -17, -25, -29, -39, -40, -41, -43, -60)의 추출물이 항균효과가 있는 것으로 나타났고, 그람 양성균인 Staphylococcus aureus에 대한 항균활성을 측정한 결과 7점(Bn-3, -16, -25, -33, -35, -38, -41)의 추출물이 항균 효과를 보였으며, Helicobacter pylori의 항균활성을 측정한 결과 90점의 모시 추출물은 15 μg/ 30 μL 농도에서 7점의 추출물(Bn-3,-5, -21, -37, -38, -45, -61)이 강한 항균력을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 90점의 모시 추출물을 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 5점의 추출물(Bn-2, -7, -10, -23, -28)에서 50% 이상의 위암 세포 성장 억제율을 나타냈다. 특히 이들 중에서도 Bn-2와 Bn-23은 85% 이상의 높은 위암 세포 성장 억제율을 보였고, Bn-23은 90.79%로 위암세포의 증식을 가장 크게 억제하는 것으로 사료된다. 90점의 추출물을 100 μg/mL의 농도로 Raw 264.7 세포에 처리 시 LPS와 INF-γ가 내독소로 작용하여 cell viability에서는 Normal 군과 Control 군의 차이가 크지 않았다. NO 생성율을 보면 Normal 군은 44.18%, Control 군이 100%의 NO 생성율을 보였고, 총90점의 추출물 중 88점이 80% 이하의 NO 생성율을 나타내었으며, Bn-09, -65에서 항염증 효과가 있는 것으로 나타났다. 90점의 모시 추출물의 Aldose reductase 억제 활성을 측정한 결과, 총 11점의 추출물(Bn-06, -07, -08, -09, -31, -33, -44, -46, -47, -48, -52)에서 50% 이상의 억제 활성을 나타냈고, 그 중 Bn-08, Bn-33, Bn-48은 각각 64.94, 60.63, 63.58%로 60% 이상의 비교적 강한 억제활성을 나타냈다. 또한 HPLC 분석을 통해 모싯잎 4점(Bn-09, -40, -82,-90)과 모시식품 4종(모시찰보리찜떡, 모싯잎송편, 모싯잎떡, 모싯잎차)의 기능성 물질(Epicatechin과 Epicatechin gallate)의 함량분석 및 표준화 작업을 수행한 결과 Bn-09는 Epicatechin의 함량이 4점 중에서 가장 높았으나 Epicatechin gallate의 함량은 가장 적었고 Bn-90은 가장 높은 Epicatechin gallate 함량을 보였다. 또한 4점 모두 Epicatechin보다 Epicatechin gallate를 더 많이 함유하고 있음을 확인할 수 있었다. 모시식품 4종 내의 성분함량을 분석한 결과, 마음소리 모싯잎차 내 두 성분의 함량이 식품 4종 중에서 가장 높은 것으로 확인되었다.
2차년도에서는 모싯잎의 고유 기능성물질 분리분석 및 함량 탐색을 실시하였으며, 먼저 모싯 잎 2 kg을 건조시킨 후 MeOH을 이용 추출용매와 함께 가열해 끓이면서 동시에 환류냉각을 시키는 온침법을 이용하였다. 위 방법으로 추출된 추출물을 filter paper를 이용해 걸러준다음 evaporator를 이용해 감압 농축하였다. 이 과정을 3번 반복하여 시행하였고, 총 294.6 g의 methanol 추출물을 얻었다. 분획은 n-hexane, CH₂CL₂, EtOAc, 그리고 n-butanol 순으로 진행하였다. Methanol 추출물 294.6 g을 증류수를 이용해 현탁한 후 분획여두에 넣고 그 위에 n-hexane을 넣은 다음 흔들어 잘 섞어준 후 극성의 차와 비중에 따라 분리된 용매 층만을 얻었다. 여기에서 남은 물 층을 같은 방법으로 CH₂CL₂, EtOAc 그리고 n-butanol으로 다시 분획을 하였고 각각 3회씩 반복하여 주었다. 그 결과 n-hexane fr. 106.9 g CH₂CL₂ fr. 4.1 g, EtOAc 분획 2.4 g, n-butanol 분획 23.8 g의 분획물을 수득하였고 각각의 분획물은 chromatography (MPLC, open Column Chromatography)를 이용하여 물질분리를 하였다. 그결과 hexane 분획에서 분리된 물질 중 4번 분획 물질의 TLC를 확인한 결과, 단일 물질임을 확인하여 NMR과 MS를 찍어서 β-sitosterol로 물질의 구조를 동정하였고, 6-8번 분획 물질의 TLC를 확인한 결과, 단일 물질임을 확인하여 ¹H-NMR과 MS를 찍어서 물질의 구조를 (-)-loliolide로 동정하였다. EtOAc 분획에서 분리된 물질 중 7번 분획의 물질의 TLC를 확인한 결과, 단일 물질임을 확인하여 NMR과 MS를 찍어서 Rutin으로 구조 동정하였다. BuOH 분획에서 분리된 물질 중 2번 분획 물질의 TLC를 확인한 결과, 단일 물질임을 확인하여 NMR과 MS를 찍어서 물질의 구조를 Pyrimidinedione으로 동정하였다. 분리한 물질 중 (-)-loliolide와 rutin 두 물질에서 좋은 효능들이 보고되어서 총 9점(Bn-02, -07, -10, -23, -38, -41, -67, -76,-90)의 모싯잎을 각각 6, 7, 8, 9월에 채집하여 추출물에서 함량 비교 실험을 진행하였다. 그중에서 (-)-loliolide와 rutin은 각각 Bn-23과 -76에서 가장 함량이 많은 것으로 나왔으며, 월별로는 9월에 채집한 모싯잎에서 가장 많은 함량을 보였다.
3차년도에서는 모싯잎 고유 기능성물질의 in vivo 동물실험을 통한 약리 연구를 진행하였으며, 총 9점(Bn-02, -07, -10, -23, -38, -41, -67, -76, -90)의 모싯잎 추출물과 rutin을 이용하여 진행하였다. In vivo에서의 모시의 인지능력 향상효과를 보았으며, 인지능력 향상효과는 T-maze 실험과 물체 인지 실험을 통해 공간인지 능력과 물체인지 능력향상을 보았다. 조직에서의 산화적 스트레스 개선 효과는 지질과산화 생성 억제 효과, NO 소거 효과와 혈청 중의 ALT와 AST 측정을 하였으며, 위 실험 결과 Bn-02와 Bn-90에서 효과가 우수한 것으로 나타났다. 또한 활성물질 분리물(rutin)의 in vivo 효능 및 작용을 보았으며, 신경세포 보호효과와 기능성 작용의 관계를 보았다. 신경세포의 염증반응에 대한 보호효과를 알아보기 위해 C6 glial cell에 SNP를 처리하여 NO를 유발시켰으며, rutin을 처리한 결과 세포 생존율이 상승하여 염증에 대한 보호효과가 있는 것으로 사료된다. H₂O₂와 Aβ_25-35처리로 유도된 산화적 스트레스 개선 효과를 본 결과, 신경세포의 세포사멸 보호능 및 세포내 ROS 소거능과 상관관계를 가지고 있으며, 이러한 활성이 ROS에 의해 야기되는 뇌세포 사멸에 대한 보호 작용의 역할을할 것으로 사료된다.
3. 품종 판별용 분자마커 개발
모시풀은 쐐기풀과에 속하는 목본성 다년생 초본식물이며, 한국을 포함한 아시아 지역의 여러 국가들에서 주요 섬유작물로 재배하고 있다. 모싯잎은 전통적으로 한국 남부지방(특히, 영광 지역)에서 송편을 비롯한 떡의 주요 성분으로 사용되어 오고 있다. 모시풀의 경제적 중요성에도 불구하고, 모시풀의 분자유전학적 측면에 관한 연구는 이루어진 바가 없다. 모시풀의 경제 산업적 활용을 위해 영광군 농업기술센터에 의해 모시풀 유전자원이 전국적으로 수집되었다. 90점의 모시풀 유전자원으로부터 증폭된 핵 리보소말 ITS 서열을 비교한 결과, 유전자원간에 크기나 서열 변이가 없었으며, 모시풀에 대한 기준 시료와도 서열 변이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 모든 유전자원이 분류학적으로 모시풀로 분류됨을 제시한다. 모시풀 유전자원의 체계적이며 효율적인 관리를 위해 마그네틱 비드 혼성화 선발 방법을 이용하여 모시풀 SSR 마커를 발굴하였다. 최종적으로 유전자원 간에 다형성을 보이는 17개 SSR 마커가 선발되었으며, 모시풀 유전자원의 유전다양성 분석을 수행하였다. 선발된 17개 SSR 마커는 총 140개 대립유전자를 검출하였다(유전자원당 3-17개). 유전다양성과 PIC의 평균값은 각각 0.61과 0.56이었다(유전다양성은 0.37-0.84 범위, PIC는 0.34-0.82 범위). SSR 데이터에 기초한 유전 군집분석 결과, 모시풀 유전자원은 4개 그룹으로 나누어질 수 있음을 보여주었다. 8개 SSR 마커를 이용한 일부 유전자원의 순도검정 결과는 일부 유전자원의 순도에 문제가 있을 수 있음을 제시하였다. 향후 모시풀 품종에 대한 고효율 저비용의 지노타이핑을 위해서 본 연구에서 개발된 12개 SSR 마커를 이용하여 동시 다중 지노타이핑 플랫폼을 구축하였다.
엽록체 유전체는 진화와 계통에 관한 풍부한 정보를 제공한다. 높은 빈도의 삽입-결실(InDel)이나 단일염기다형성(SNP)과 같이 빠른 진화가 일어나는 부위가 엽록체 유전체상의 특정 유전자, 유전자간 서열(IGS) 및 인트론 등에 집중해서 나타난다. 따라서 진화속도가 빠른 부분에서의 서열 변이 정보를 활용하여 종과 변종을 구분하기 위한 DNA 바코딩 마커로 개발하고 있다. 모시풀 품종 구분을 위한 바코딩 마커를 개발하기 위하여 Illumina Hiseq 플랫폼을 이용하여 모시풀 엽록체 유전체를 완전히 해독하였다. 모시풀 엽록체 유전체의 크기는 156,037염기쌍이었으며, 한 쌍의 역반복, 각각 한 개씩의 large single copy (LSC)와 small single copy (SSC) 영역으로 이루어져 있었다. 모시풀 엽록체에는 전체 118개의 유전자가 존재하였는데, 83개의 단백질 암호화 유전자, 31개의 tRNA 유전자, 4개의 rRNA 유전자가 존재하였다. 유전자간 서열(atpF-atpH, psbK-psbI, trnL-trnF)과 인트론(atpF, trnL, trnV)을 선발하여 16개 모시풀 유전자원간 서열변이를 탐색하였다. 2개의 IGS 서열(atpF-atpH, psbK-psbI )과 2개의 인트론(atpF, trnL)은 16개 자원간 InDel이나 SNP를 보여주었다. 그러나 trnL-trnF IGS와 trnV 인트론 영역은 유전자원간 서열변이가 존재하지 않았다. 따라서 IGS와 인트론에서 발굴된 서열변이는 모시풀 유전자원, 품종 구분, 원산지 판별 등을 위한 중요한 바코딩 마커로 활용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Mosiddeok (half moon shaped rice cake which is made of the mixed dough with ramie leaves) is one of the Korean traditional dishes that has increased in consumption at domestic and foreign market. Therefore, it is very important to secure the supply of raw materials and standardization of quality, an

Mosiddeok (half moon shaped rice cake which is made of the mixed dough with ramie leaves) is one of the Korean traditional dishes that has increased in consumption at domestic and foreign market. Therefore, it is very important to secure the supply of raw materials and standardization of quality, and investigation of the functional materials like antibiotic and antioxidative effects in order to gain consumer's truth in the age of well-being.
This studies carried out the selection of elite variety with high yield and good quality, in vitro and in vivo investigation of the functional materials, and its potency test, and identification of genetic resources using SSR markers. The results were as follows.
1. Selection of elite line and application for plant variety protection right in ramie
Ramie was mainly used as a material of summer clothing not for edible purposes in most of regions in Korea. However, in some parts of the country including Yeonggwang-gun, ramie leaves have long been used to make Songpyeon because ramie leaves contain various and beneficial nutrients for human health.
Ramie is a clonal crop, so the breeding methods applied are similar to sugar cane or potato. A clone is a group of genetically identical plants that was vegetatively propagated from a single plant. In this experiment, breeding procedures were grouped into (1) germplasm collection and maintenance, and (2) clonal selection of natural variants. As with crops that reproduce sexually, the initial step for the breeding of asexually propagated species is to establish a germplasm collection and maintenance system. Yeonggwang-gun Agricultural Technology Center collected ninety ramie accessions in 2013 through RDA and local collection of clones. Selection procedures of the elite ramie clone for edible leaf were consisted of the elite clone selection and the test of specific characters including leaf size, leaf color, processing quality, and fresh leaf yield. Forty elite accessions were selected from the primary step, and then ten accessions were finally selected from the last step on the basis of yield and quality. Ten elite accessions including a control variety, 'Seobang' (a variety for fiber developed in 1961) were used for the evaluation of yield potential and genetic characteristics from 2014 to 2015 at the greenhouse and the field. As a result, we selected Bn-90-22 and designated as "Yeonggwang 1" in 2015. "Yeonggwang 1" has various traits such as erect stem, purple flower color, white pubescence, dark green leaf color, light brown petiole color, and large leaf size. The total fresh leaf yield per year was 1,578 kg/10a, which was higher by 10% than 'Seobang', a control variety.
The elite accession, "Yeonggwang 1" (Bn-90), was named 'Ogdang' as a new variety and applied variety protection in 2015. Ogdang, a new mid-late maturing ramie variety for edible leaf, was derived from a clone of Bn-90, and was promoted through a pure line selection method.
2. Screening of phytochemicals and biological activities of Boehmeria nivea
Anti-oxidant (DPPH and ·OH radical-scavenging activity), anti-bacterial, anti-cancer(MTT assay), anti-inflammatory activities, and aldose reductase (AR) inhibition were to evaluate the biological activities of extracts of ramie (Boehmeria nivea, Bn). Bn extracts from various collecting area (90 kinds) were extracted with methanol. Among them, 34 kinds of Bn extracts are responsible for more than 80% of the observed radical scavenging activity at a concentration of 100 μg/mL. In particular, Bn-13 and -82 showed a higher capacity than the other extracts, showing 95.17 and 90.71%, respectively. Also, the result of·OH radical scavenging activity demonstrated that all Bn extracts showed over 80% scavenging activity. The results from radical scavenging systems reveal that Bn extracts have a significant anti-oxidant effect. The result of anti-bacterial activity against Escherichia coli, a Gram negative bacteria, demonstrated that the following 11 Bn extracts(Bn-06, -10, -15, -17, -25, -29, -39, -40, -41, -43, and -60) showed growth inhibition zones greater than 15 mm. Seven kinds of Bn extracts (Bn-03, -16, -25, -33, -35, -38, and-41) produced inhibition zones of Staphylococcus aureus greater than 15 mm. The result for Helicobacter pylori, which causes gastritis and gastric cancer, includes seven Bn extracts (Bn-03, -05, -21, -37, -38, -45, and -61) that produced zones of H. pylori inhibition greater than 12-14 mm. We found that Bn-02 and -23 significantly inhibited the growth of AGS cells by greater than 85%. Bn-23 had the greatest anti-cancer effect, with growth being inhibited by 90.79%. NO production from LPS/IFN-γ-activated RAW 264.7 cells was inhibited by Bn extracts (Bn-01, -11 and -37), which showed less than 85% of NO generation at a non-toxic concentration. Bn-37 significantly inhibited the production.The following 11 Bn extracts (Bn-06, -07, -08, -09, -31, -33, -44, -46, -47, -48, and -52) exhibited a high degree of inhibition (>50% at 10 μg/mL) on rat lens AR. Also, content analysis of flavonoids (epicatechin and epicatechin gallate) present in the leaves of B. nivea(Bn-09, -40, -82, and -90) and their commercial products (ramie tteok, ramie songpyeon, ramie bory-tteok, and ramie tea) was conducted by HPLC. The content of epicatechin and epicatechin gallate was highest in the leaves of B. nivea from Bn-09 and Bn-90, respectively. With respect to commercial products, the content of epicatechin and epicatechin gallate was highest in ramie tea.
Furthermore, phytochemical constituents were isolated from Bn. The dried and powdered Bn-90 (2 kg) were extracted with MeOH (8 L × 10) under reflux at 65-75°C and filtered. The filtrate was concentrated in vacuo to afford a material of MeOH extract (294.6 g). The MeOH extract (280.5 g) was suspended in H₂O, and then partitioned successively using n-hexane (106.9 g), CH₂Cl₂ (4.1 g), EtOAc (2.4 g), and n-BuOH (23.8 g). Their structures were identified as β-sitosterol, (-)-loliolide, rutin, and pyrimidinedione by MS, ¹H-, and¹³C-NMR spectroscopic analysis. Among them, (-)-loliolide was isolated for the first time from the plant. In addition, content analysis of (-)-loliolide and rutin in Bn collected from different regions and harvest times were conducted by HPLC. The highest content of(-)-loliolide and rutin were found in Bn-23 and -76 harvested in September.
Finally, we demonstrated the protective effects of Bn-0₂ and -90 extracts against cognitive dysfunction using an Aβ-injected mice model of Alzheimer disease. We carried out mouse behavior tests using the T-maze, novel objective recognition, and Morris water maze tests. Normal rats and Aβ_25-35-induced rats administered with rutin showed the high spatial memory ability under Morris water maze. Moreover, the inhibitory effects on lipid peroxidation, as well as NO scavenging activity, were also investigated. We screened their neuroprotective effect to attenuate H₂O₂ and Aβ_25-35-induced oxidative stress in C6 glial cells. Treatments with Bn extracts led to an increase in cell viability and decrease in ROS production induced by H₆O₆ and Aβ_25-35.
3. Development of molecular markers for the identification of ramie cultivars
Ramie (Boehmeria nivea L.) is a hardy perennial herbaceous plant of the Urticaceae family and has been grown as an important fiber crop for many centuries in Asian countries including Korea. Ramie leaves also have been traditionally used as a major ingredient of a type of rice cake called 'Song-pyun' in the Southwest area of Korea. Despite its economic importance, the molecular genetics of ramie have not been studied in detail yet. Genetic resources of ramie were widely collected from domestic local sites by Yeong-Gwang Agricultural Technology Center. Nuclear ITS sequences amplified from 90 genetic resources showed no variation in size and sequence among the resources and from the reference samples for B. nivea, indicating that all of the genetic resources is taxonomically classified into B. nivea. For the systematic and efficient management of the genetic resources, we developed ramie SSR markers using the magnetic bead hybridization selection method. Finally, we selected 17 SSR markers, possibly showing polymorphism among the genetic resources and analyzed their genetic diversity. The selected 17 SSR markers detected a total of 140 alleles, ranging from 3 to 17. The average values of genetic diversity and PIC were 0.61 and 0.56, ranging from 0.37 to 0.84 and from 0.34 to 0.82, respectively. A genetic cluster analysis based on SSR data revealed that the ramie genetic collection could be distinctly classified into 4 clusters. The purity test on several genetic resources using 8 polymorphic SSR markers also revealed that some of the resources is not pure. For the rapid and money-saving genotyping, we also set up a multiplex genotyping platform using 12 polymorphic SSR markers developed in the study.
Chloroplast (cp) genomes provide rich evolutionary and phylogenetic information. Evolutionary hot spots showing high levels of insertion-deletions (InDels) with high incidences of SNPs are concentrated on specific gene, intergenic spacers (IGS) and introns in the cp genome. Therefore, sequence variation on the evolutionary hot spots is adopted to develop DNA barcoding markers that are able to discriminate species and cultivars. In order to develop the barcoding markers for ramie cultivar identification, we determined the complete cp genome sequence using Illumina Hiseq platform. The complete cp genome is 156,037 bp in length, and has a pair of inverted repeat (IR), a large single copy (LSC), and a small single copy regions. A total of 118 gene species are contained within the ramie cp genome, including 83 protein-coding genes, 31 tRNA genes, and 4 rRNA genes. IGS(atpF-atpH, psbK-psbI and trnL-trnF) and intron (atpF, trnL and trnV) regions were selected to search sequence variations among 16 ramie accessions. Two IGS (atpF-atpH, psbK-psbI ) and atpF intron showed SNPs and InDels among the accessions. SNPs were detected among trnL introns of the accessions. However, no sequence variations among the accessions were detected in trnL-trnF IGS and trnV intron regions. The sequence variations detected in IGS and introns will be valuable barcoding markers to discriminate ramie accessions and cultivars.