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Kafe 바로가기주관연구기관 | 한국식품연구원 Korea Food Research Institute |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2015-12 |
과제시작연도 | 2014 |
주관부처 | 농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 | TRKO201600003490 |
과제고유번호 | 1545009391 |
사업명 | 농생명산업기술개발 |
DB 구축일자 | 2016-07-02 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201600003490 |
Ⅴ. 연구개발결과
1.국내 자생 생강과 식물을 포함한 9종의 조추출물 제조 및 표준추출법 결정
식품첨가물 적용가능성을 고려하여 식품첨가물공전이 정하는 주정과 그 외 활성성분 분리를 위한 MTBE를 추출용매로 국내 자생생강과 식물 중 양하의 메탄올추출물 등 3종과 생강, 강황 메탄올 추출물, 강황 MTBE 추출물, 참여기업이 요청한 석류, 매실, 유자의 메탄올 추출물 등 총 9종의 조추출물을 제조하여 제공하였고 항균활성법과 violacein 억제활성 검증을 통하여 70% 주정추출물에 의한 추출법을 표준으로 확정
2.
Ⅴ. 연구개발결과
1.국내 자생 생강과 식물을 포함한 9종의 조추출물 제조 및 표준추출법 결정
식품첨가물 적용가능성을 고려하여 식품첨가물공전이 정하는 주정과 그 외 활성성분 분리를 위한 MTBE를 추출용매로 국내 자생생강과 식물 중 양하의 메탄올추출물 등 3종과 생강, 강황 메탄올 추출물, 강황 MTBE 추출물, 참여기업이 요청한 석류, 매실, 유자의 메탄올 추출물 등 총 9종의 조추출물을 제조하여 제공하였고 항균활성법과 violacein 억제활성 검증을 통하여 70% 주정추출물에 의한 추출법을 표준으로 확정
2.신호전달 교란물질 활성법을 구축하여 신호전달 교란활성 후보물질 선발
신호전달 교란활성을 측정하기 위해 C. violaceum (1차선별), C. violaceum CV026 (2차선별)을 표준균주로 보라색색소 생성 억제환을 측정하는 violacein inhibition assay 방법을 구축하였고 동시에 agar well diffusion법으로 항균활성 (주요 식중독균 5종 대상) 을 측정하여 신호전달 교란물질 활성 후보추출물로 양하, 석류, 유자의 메탄올 추출물을 선발하였고 항균활성 후보추출물은 양하, 석류, 매실 메탄올 추출물을 선발
3.선발된 후보추출물에 대한 생리활성평가 기반 유효성분 분리,동정 및 구조 분석
신호전달 교란 활성성분의 동정과 구조 분석은 바이오필름 억제활성평가 (대상균주: Y. enterocolitica, P. aerusinosa) 를 기반으로 분획하였고 휘발성 양하 분획의 GC/MS 구조분석 결과는 주성분이 geranyl-α-terpinene이고 terpinen-4-ol, geranyl-p-cymene, borneol acetate 등으로 확인되었으며, 항균활성 기반 분획은 비 휘발성분 중 양하 ether:ethyl acetate (50:50) 분획 활성이 높아 GC/MS와 NMR에 의한 항균활성 성분 동정 및 구조분석을 수행, 비교한 결과 isoeugenol, nomilin, β-sitosterol, β-Pinene, α-Terpineol 일 것으로 추정
4.신호전달 교란 활성성분에 대한 생리학적 특성 및 항균소재 후보의 제어기작 규명
선발된 후보물질에 대하여 violacein 억제활성, 바이오필름 생성 억제능 (대상균주: Y. enterocolitica, P. aerusinosa), Swarming 억제활성, 신호전달 물질 분해능을 확인 (분해대상물질: C6-HSL, 3-oxo-C6-HSL) 한 결과 양하II와 석류II 분획이 모든 생리 활성이 높게 나타났으며 121℃ 열에도 안정한 것으로 확인되었으며 선발 후보물질들 모두 Y. enterocolitica 의 신호전달물질 합성 유전자 yenI의 mRNA 발현수준을 낮추고 바이오필름(독소발현) 형성 에 관여하는 flagella 조절유전자 fliA, fleB, flhDC의 발현 억제 확인
5.항균복합소재 제조 최적조건 확립 및 신호교란항균활성 기반 최종후보 선정
신호전달 교란활성이 가장 좋은 복합물은 양하 물추출물과 석류 메탄올 추출물의 1:2 인 복합물(활성 30% 증가) 이었으며, 항균활성이 높은 추출물의 비율별 복합제제는 양하 E/A추출물과 황매실 메탄올 추출물의 1:2 비율인 2번 복합물(활성 50% 증가)과 양하 E/A추출물, 황매실 메탄올추출물, 매실 주정추출물이 1:1:1 비율인 7번 복합물(활성 30% 증가)로 3종의 복합물 모두 10℃, 25℃, 45℃에서 30일 동안 보관하면서 외형변화와 활성변화 없이 안정적 발현이 확인되었으며 최종 항균활성복합물로 신호전달 교란활성복합물과 항균활성복합물 2번의 1:1 혼합제제가 선정되었으며 특히 신호전달 교란 활성복합물을 혼합할 때에는 기존 대비 항균물질이 50% 만 첨가되어도 동일한 활성 발현
6.산업화를 위한 항균 단일복합소재의 응용기술 개발
항균활성복합물에 대한 제제 유형별 (용액, 분산, 반고형, 분립체 등) 항균활성, 제제 유형별 온도와 저장기간에 대한 안정성과 품질평가 등을 그람음성균과 양성균을 대상으로 수행하였고 제품화를 고려하여 급성경구독성시험과 피부자극시험을 실시하여 얻어진 결과를 기반으로 하여 액상제품으로 손세정제, 고상제품으로 천연비누와 사료첨가제로 제조하여 산업화를 위한 기초실험을 하였으며 추가적으로 치약, 구강청결제의 첨가제로의 자료도 확보
7. 신호전달 교란 및 항균활성 복합소재에 의한 미생물 대사체 비교 분석 (위탁과제)
선발된 신호전달 교란 물질을 처리한 Y. enterocolitica 와 항균활성을 갖는 복합소재를 처리한 S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes, E. coli 0157:H17, Salmonella sp. 균체와 배지들의 대사체 분석을 LC/MS와 GC/MS를 이용하여 분석하고 다변량통계분석을 통해 관련 지표물질들을 발굴하였음. 신호전달 교란 물질을 처리한 Y. enterocolitica인 경우 균체에서 Asp-Glu-Asn, 5'-deoxy-5-(methythio)adenosine, C16 sphiganine, oleamide, LysoPE(16:1)가 유의적으로 차이가 나는 것으로 확인되었고 양하 추출물의 경우 biofilm를 형성에 관여하는 valine의 변화가 관찰되었으며 nicotiamide, hypoxanthine, adenosine, guanosine 등 DNA,RNA 분해 부산물 함량이 균체내에서 증가하였으며 항균물질 처리후 균체 및 배지 대사체 분석 결과 균체에서 지방, 펩타이드, 핵산분해산물들의 함량이 크게 증가함
Ⅴ. Research and development results
1. Manufacture of crude extracts from 9 species, including domestic wild Zingiberaceae plants and determining standard extraction protocols
Crude extracts were manufactured and provided for all 9 species, including methanol extracts of 3 species of in domest
Ⅴ. Research and development results
1. Manufacture of crude extracts from 9 species, including domestic wild Zingiberaceae plants and determining standard extraction protocols
Crude extracts were manufactured and provided for all 9 species, including methanol extracts of 3 species of in domestic wild Zingiberaceae plants such as Zingiber mioga, methanol extracts of ginger and turmeric, an MTBE extract of turmeric, and additional methanol extracts of pomegranate, Korean plum, and citron, which were requested by a collaborating company. Ethanol and MTBE, to separate other active compounds, were used as the solvents for extraction, as indicated by the Korean Food Additives Codex, in order to account for future applicability as food additives. The standard extraction protocol was finalized as 70% alcohol extracts, after verifying antimicrobial activity and violacein inhibitory activity.
2. Selection of candidate substances that disrupt signal transduction by establishing the activity of signaling disturbances
To measure the quorum sensing inhibition activity, the violacein inhibition assay was developed, in which the zone of inhibition of purple pigmentation is measured using C. violaceum (1stselection) andC. violaceum CV026 (2ndselection) as standard strains. At the same time, antimicrobial activity (5 major food poisoning bacteria) was also measured using the agar well diffusion method and candidates that inhibit quorum sensning, such as methanol extracts of ginger, pomegranate, and citron, and candidates that show antimicrobial activity, such as methanol extracts of ginger, pomegranate, and plum.
3. Fractionation, identification and structural analysis of active ingredients based on the evaluation of physiological activity for the selected candidate extracts
Identification and structural analysis of that active ingredients that inhibit quorum sensing was performed as follows: extracts were fractioned based on the biofilm inhibitory activity (Target strains: Y. enterocolitica, P. aerusinosa), and GC/MS structural analysis was performed on the volatile Zingiber mioga fraction, confirming that the major ingredients were geranyl-α-terpinene, terpinen-4-ol, geranyl-p-cymene, and borneol acetate. As for fractionation based on antimicrobial activity, among non-volatile compounds, the ether:ethyl acetate (50:50) fraction of Zingiber mioga showed high activity, and so identification and structural analysis of the antimicrobial active ingredients was performed using GC/MS and NMR. The major active compounds were found to be isoeugenol, nomilin, β-sitosterol, β-Pinene, and α-Terpineol.
4. Characterization of physiological properties for the active ingredients that inhibit quorum sensing, and Identification of control mechanism of the candidate antimicrobial materials.
We confirmed violacein inhibitory activity, biofilm inhibitory activity (target strains: Y. enterocolitica, P. aerusinosa), swarming inhibitory activity, and the ability to degrade auto-inducer molecules (degradation targets: C6-HSL, 3-oxo-C6-HSL) for the selected candidates. The ginger II and pomegranate II fractions were shown to have higher physiological activity and be stable at 121°C. Selected candidates reduced expression of yenI mRNA, which is a gene that synthesizes quorum sensing inhibition substances in Y. enterocolitica, and inhibited the expression of fliA, fleB, flhDC, which are flagella regulating genes involved in biofilm formation (toxin expression).
5. Selection of final candidates based on antimicrobial activity and ability to disrupt signal transduction, and establishment of optimal conditions for the manufacture of combination antimicrobials.
The combination with the best quorum sensing inhibition activity was the 1:2 mixture of Zingiber mioga and pomegranate methanol extracts (30% increased activity). Combinations with different ratios of extracts that showed high antimicrobial activity included Combination No. 2, which was 1:2 mixture of Zingiber mioga E/A extract and yellow plum methanol extract (50% increased activity), and Combination No. 7, which was a 1:1:1 mixture of Zingiber mioga E/A extracts, yellow plum methanol extract, and Korean plum alcohol extract (30% increased activity). When stored for 30 days at 10°C, 25°C, or 45°C, all 3 complexes were confirmed to show stable expression and no change in activity or external appearance. As the final antimicrobial combination, a 1:1 mixture of antimicrobial Combination No. 2 and the quorum sensing inhibitors combination was selected, and in particular, the same activity was observed when adding only half as much antimicrobial agent as conventional formulations.
6. Development of applied technologies using single/combination antimicrobial material(s) for commercialization.
We performed evaluations of antimicrobial activity using various formulation types (solution, dispersion, semi-solid, powder, etc.) and, evaluation of safety and quality for various temperatures and storage durations with gram-negative and gram-positive bacteria. Additionally, we manufactured liquid hand sanitizer products, and natural soap and food additives as solid products, based on the results of acute oral toxicity and skin irritation tests. We also performed primary experiments for commercialization, and secured data for use as an additive in toothpaste and oral cleaners.
7. Metabolomic analysis of cells and their growth media treated with quorum sensing agents and the mixture of anti-microbial compounds (Researches commissioned)
Metabolites from the Y. enterocolitica and its medium treated with quorum sensing agents and five microorganims (S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes, E. coli 0157:H17, Salmonella sp.) and their growth media treated with the mixture of anti-microbial compounds were analyzed by LC/MS and GC/MS and the related biomakers were identified. From Y. enterocolitica, the levels of Asp-Glu-Asn, 5'-deoxy-5-(methythio)adenosine, C16 sphiganine, oleamide, and LysoPE(16:1) were significantly changed by the treatment of quorum sensing agents. In addition, nicotinamide, hypoxanthine, adenosine, and quanosine associated with the degradation of nucleotide and valine related with bioflim production were significantly changed by the anti-microbial compounds.
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