초록 ▼

인체와 실험동물에 치명적인 원발성 아메바성 수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis; PAM)을 유발하는 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 주요 감염 경로인 수중활동을 통한 감염례가 최근 지구 온난화에 따른 지표수의 수온증가와 연관 되어 전 세계적으로 증가하고 있어 사회적 이슈가 되고 있음. 본 연구는 배양중인 N. fowleri를 이용하여 간편한 PCR법을 확립하고 PAM을 발생시킨 마우스(PAM-마우스)의 뇌조직 및 뇌척수액에서 효율적인 PCR 검출(진단)법을 구축하고자 하였음

인체와 실험동물에 치명적인 원발성 아메바성 수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis; PAM)을 유발하는 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 주요 감염 경로인 수중활동을 통한 감염례가 최근 지구 온난화에 따른 지표수의 수온증가와 연관 되어 전 세계적으로 증가하고 있어 사회적 이슈가 되고 있음. 본 연구는 배양중인 N. fowleri를 이용하여 간편한 PCR법을 확립하고 PAM을 발생시킨 마우스(PAM-마우스)의 뇌조직 및 뇌척수액에서 효율적인 PCR 검출(진단)법을 구축하고자 하였음. PCR법을 위 해 여러 연구자들이 환자의 뇌척수액과 뇌조직 및 환경내에서 아메바 검출을 위해 사용한 primer들(Nae3, Nf-ITS, Naegl)과, 본 연구진이 개발한 Nfa1 primer를 사용하였음. 다양한 genomic DNA 추출방법 중에 N. fowleri 영양형(1x10⁶)을 모아 10 ul의 PBS(pH 7.4) 에 부유시킨 후 100℃에서 30분간 끓여주는 DNA 추출법이 가장 신속하고 간편한 방법이었으며, Nfa1 및 Nae3 primer가 가장 잘 증폭하였음(2.5x10²까지 검출). 종-특이도 관찰 결과, Nfa1 및 Nae3 primer로는 N. fowleri의 DNA만 증폭할 수 있었고, ITS primer 로는 N. fowleri와 N. gruberi DNA까지 증폭되었으며, Acanthamoeba castellanii 및 A.polyphaga는 3종류 모두로 증폭되지 않았음. N. fowleri 영양형(1x10⁵)을 마우스 비강내로 접종하여 실험적 PAM이 발생한 마우스(PAM-마우스)의 뇌 조직에서는 Nfa1 primer 가 감염 후 4일째부터 그리고 1 ng/ul의 DNA까지 증폭할 수 있어 Nae3 및 ITS primer보다 민감도가 높았음. PAM-마우스의 뇌척수액(2 ul)에서 Nfa1 primer로는 감염 후 5일째, 한편 Nae3 primer로는 4일째부터 N. fowleri의 DNA를 증폭할 수 있었음. 결론적으로 배양기내와 PAM-마우스 뇌조직 표본에서는 Nfa1 primer 그리고 뇌척수액에서는 Nae3 primer가 가장 좋은 민감도를 갖고 있어 2개의 primer 쌍을 사용하고, 아메바의 genomic DNA 추출방법은 100℃에서 30분간 끓이는 단순한 DNA 추출법이 가장 효율적인 방법임을 제안함.

한편 자연환경 내 검출법 실험결과, 자연환경 즉, 하천, 강, 연못 등에서 1L의 샘플(물)을 채취하여 1차로 일반적인 와트만 필터를 이용하여 큰 불순물들을 거른 후, 걸러진 용액을 다시 0.45 um pore-size filter를 이용하여 2차로 filtration 시행하고 50 ml 남겨 잘 혼합하고 원심침전 시킨 뒤, 침사를 미리 준비된 아메바 배양용 한천배지 위에 얹어놓고 37℃ 배양기 내에서 배양하여 아메바의 유무를 검출하는 방법이 최적의 조건이었음. 이후 있을 국내 분포조사에서 표준화된 검출법으로 활용이 가능 할 것임.

Abstract ▼

Pathogenic Naegleria fowleri is a causing agent of an acute and lethal primary amoebic meningoencephalitis (PAM) in animals and humans. Increasing PAM cases are becoming a serious issue in the subtropical and tropical countries as the Neglected Tropical Diseases (NTD). To establish the rapid and eff

Pathogenic Naegleria fowleri is a causing agent of an acute and lethal primary amoebic meningoencephalitis (PAM) in animals and humans. Increasing PAM cases are becoming a serious issue in the subtropical and tropical countries as the Neglected Tropical Diseases (NTD). To establish the rapid and efficient diagnostic tools, in this study PCR-based detection technique was carried out by using the cultured amoebic trophozoites and experimentally PAM-developed mouse due to N. fowleri inoculation (PAM-mouse). In this study four kinds of primer pairs, Nfa1 primer, Nae3 primer, Nf-ITS primer Naegl primer, were used. On the extraction methods of genomic DNA from N. fowleri trophozoites (1x10⁶), a simple boiling with 10 μl of PBS (pH 7.4) at 100℃ for 30 min, as which amplified 2.5x10² of trophozoites using Nfa-1 and Nae3 primer, was the most rapid and efficient procedure among various extraction methods including commercial kits. For the species-specificity, Nfa1 and Nae3 primer amplified only the N. fowleri DNA, whereas ITS primer detected the N. fowleri and N. gruberi DNAs. On the other hand, all primers did not amplify the Acanthamoeba castellanii and A. polyphaga DNAs. Using the PAM-mouse brain tissue, Nfa1 primer amplified the N. fowleri DNA on 4 days post infection, and for the sensitivity 1 ng/μl of genomic DNA was detected with Nfa1 primer. Using the PAM-mouse CSF, Nae3 primer amplified the N. fowleri DNA from CSF on 4 days post infection was better than Nfa1 primer detected from 5 days. Finally, the simple boiling procedure at 100℃ for 30 min was the best method for DNA extraction, and the Nfa1 and Nae3 primer were more useful on the detection of N. fowleri DNA from the PAM-mouse brain tissue and CSF, respectively.

In addition, the standard detection methods from samples (water, sewage) in environments (pond, stream, river) is as follows: 1L sample was put on a whatman filter which is setup with a flask. After filtration, filtrate is again put on a 0.45 um pore-size filter which is setup with a new flask. After about 50 ml of sample is setaside, suspended and centrifuged, the sediment is put on a non-nutrient aga medium and cultured at 37℃ in a incubator. Microscopic examination is done to find free-living amoeba.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 정책연구용역사업 최종결과보고서 ... 2
• 목차 ... 3
• 보고서 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 제1장 최종 목표 ... 6
• 1.1 목표 ... 6
• 1.2 목표달성도 및 관련분야에 대한 기여도 ... 10
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 11
• 제3장 최종 연구내용 및 방법 ... 12
• 제4장 최종 연구결과 ... 15
• 4.1 파울러자유아메바 간편 진단법 개발 ... 15
• 4.2 파울러자유아메바 환경조사법 구축 ... 23
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 29
• 6.1 연구성과 ... 29
• 6.2 활용계획(연구사업 종료 후) ... 30
• 제7장 정책연구용역사업 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 32
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 32
• 제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 33
• 9.1 연구비 사용 내역(작성일까지 사용내역 작성) ... 33
• 9.2 연구분담표 ... 34
• 제10장 참고문헌 ... 35
• 제11장 첨부서류 ... 37
• 끝페이지 ... 38