초록 ▼

최종목표
작물계 원료로부터 C4계 핵심 중간화학원료인 1,4-부탄다이올을 생산하기 위한 바이오, 화학 촉매 및 이를 이용한 단계적 생물/화학 전환을 위한 하이브리드 공정 개발

개발내용 및 결과
◦ 숙신산의 고농도 생산과 산업용 규모로의 적용을 위하여 산업화에 적절한 고수율 및 안정성 높은 균주의 개발을 시도하였음. 세계적인 균주개발 첨단 경향에 맞추어 균주 개발의 자동화 대량선별화를 이루어 이른바 HTS(high throughput screening) system을 개발하였음.
◦ 유전자상에 알킬화를 일

최종목표
작물계 원료로부터 C4계 핵심 중간화학원료인 1,4-부탄다이올을 생산하기 위한 바이오, 화학 촉매 및 이를 이용한 단계적 생물/화학 전환을 위한 하이브리드 공정 개발

개발내용 및 결과
◦ 숙신산의 고농도 생산과 산업용 규모로의 적용을 위하여 산업화에 적절한 고수율 및 안정성 높은 균주의 개발을 시도하였음. 세계적인 균주개발 첨단 경향에 맞추어 균주 개발의 자동화 대량선별화를 이루어 이른바 HTS(high throughput screening) system을 개발하였음.
◦ 유전자상에 알킬화를 일으키는 EMS(ethyl methanesulfonte)를 돌연변이원으로 이용하여 수행되었던 균주 개발에서 균체의 성장도 훌륭하고 숙신산도 고농도로 생산하는 UK13번 균주를 선별하였음. 본 균주는 5리터 규모의 발효조에서 최고 109 g/L 이상의 숙신산 생산량을 보이는 것을 알 수 있었으며 약 2.27 g/L/hr의 생산성과 glucose를 이용하여 최대로 생산할 수 있는 이론수율의 약 76% 수준으로 숙신산을 생산해내는 것을 확인하였음.
◦ 유전자 재조합을 통한 숙신산을 고농도로 생산하기 위한 신균주를 개발하고자 하였음. 목적 유전자로는 이산화탄소의 전환과 고정 반응을 더욱 활성 있고 강하게 발현시킬 수 있는 carbonic anhydrase (CA), bicarbonate transporter(ST), PEP carboxykinase (pckA)와 생산균주의 product inhibition 현상을 극복하기위한 succinate transporter(SucT) 를 A. succinogenes와 C. glutamicum으로부터 클로닝하였음. 발현벡터로는 pLGZ920을 이용하였고 electroporation method로 생산균주로의 transformation을 시도하였음. 새로 만들어진 균주는 발효조에서 약 100 g/L이상의 숙신산 생산량을 나타내었으며 pckA 유전자의 형질전환체는 약 104 g/L의 숙신산 생산성을 보임.
◦ 저가의 산업용 배지를 개발하고자 하였음. 통계적인 배지최적화 전략으로 두 가지 배지성분의 교호작용을 확인 할 수 있는 FFD(full & fractional factorial design), 최적 점의 최적거리를 조사할 수 있는 SAM(steepest ascent method), 최적점을 확립할 수 있는 RSM(response surface method)을 통해 현재 이용하고 있는 P medium을 개발하였음. 이 외에 초반에 공급해 주는 glucose의 농도에 따른 숙신산의 생산 변화를 관찰함으로써 initial glucose tolerance를 확인 할 수 있었으며 이론수율에 가장 근접한 122 g/L 이상의 생산성을 보이는 Y medium 역시 통계적인 전략을 통하여 개발하였음.
◦ 최적화된 배지의 성분 중 MgCO₃의 가격 대비 생산성 경쟁력을 높이고자 이산화탄소의 효율적인 공급 전략 연구를 수행함. 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, 이하 CA로 명명)를 숙신산 생산 공정에 이용하게 되었고 P medium에서 MgCO₃를 10분의 1로 줄인 10 g/L만 첨가하고 CA를 30ppm 수준으로 첨가하였을 때 본래 P medium의 생산량과 비등한 100 g/L 수준으로 숙신산이 생산되는 것을 확인하였음.
이에 더 나아가 CA의 자체생산 공정을 확보하기 위하여 남조류인 Cynobacterium sp.에서 베타그룹의 CA를 cloning 하였으며 cloning 한 유전자를 효모 종인 Pichia pastoris에 형질전환 하였음. 형질전환을 통하여 생산된 CA는 정밀한 분리정제 작업 없이 낮은 순도의 상태에서도 훌륭한 활성을 보이는 것을 확인하였고 상기 개발된 공정과 같은 30 ppm 추가 시 P medium과 같은 숙신산 생산량을 보이는 것을 확인하였음.
◦ 효율적으로 MgCO₃를 이용하고 숙신산 생산수율을 극대화 하고자 연속배양 공정을 수행하였음. 연속배양을 위한 다양한 공정전략은 첫째로 MgCO₃와 NaHCO₃의 feeding 작업을 연속배양에 접목시키는 것임. 실험 결과, carbonate의 feeding 전략을 통하여 glucose의 활용도를 극대화 시켰으며 일반 연속배양 희석속도의 wash out point를 극복하여 6~8배가량의 높은 희석속도에도 훌륭하게 조업이 되는 것을 관찰 하였으며 생산성 역시 3배 이상 증가하는 것을 관찰하였음. 이 외에도 균체 재순환 연속배양 공정을 도입하여 숙신산 생산을 극대화 하고자 하였음. Membrane을 사용하는 일반 bacteria의 세포분리기와는 다르게 밀도 차와 중력을 이용하는 세포분리기를 제작 및 사용하였으며 이러한 세포분리기를 이용하여 배양액에서 균체를 분리하여 회수 하였을 때 약 65% 이상의 균체가 회수되어 재사용 되는 것을 확인하였음. 정상상태에서 균체는 약 4배가량 증가하였으며 숙신산의 생산도 4배가량 증가한 것을 확인 할 수 있었고 특히, 생산성은 회분식에 비하여 약 8~10배가량 높은 것을 확인하였음. 이에 본 연구팀은 RVRF(reactor volume reduction factor)라는 공정평가 물질수지식을 도입하여 평가하였을 때 약 8.72의 수치를 얻을 수 있었고 이는 회분식 배양으로 생산 하는 것보다 균체재순환 연속배양 공정을 도입하였을 때 발효조 규모를 8~10배가량 축소하여 생산하여도 같은 양의 숙신산을 얻을 수 있음을 의미함.
◦ MgCO₃의 회수 실험을 통하여 사용된 배양액의 MgCO₃를 원심분리와 열풍건조에 의해 균체를 태우거나 말린 후 재사용하여도 회분식 배양에서 재사용하지 않은 것과 비교하여 비등한 생산량을 나타내는 것을 확인 할 수 있었고 MgCO₃는 약 2회 가량 재사용이 가능한 것으로 판단하였음. 또한 P medium을 이용한 회분식 배양에서 산업 scale에서의 원활한 적용을 위하여 pilot scale인 50 L 규모의 발효조로 배양을 수행하였을 때, 5 L와 동일한 수준의 생산량인 102 g/L의 숙신산 생산량을 얻을 수 있었고 이를 토대로 다양한 공정의 개선 전략을 확보할 수 있음을 확인하였음. 또한 pilot 규모의 성공적인 배양을 토대로 산업 scale으로의 적용 또한 원활하게 이루어질 것임을 전망할 수 있음.
◦ 숙신산 발효시 혐기조건의 형성과 이산화탄소의 공급을 위해 gas CO₂의 공급이 지속적으로 필요하나 이로 인해 생산배지의 pH가 더욱 감소하는 문제점을 야기함. 이로인해 pH의 조절을 위해 과량의 10N sodium hydroxide가 이용됨. 따라서 gas CO₂의 공급과 10N NaOH의 추가적인 공급없이 배지성분인 MgCO₃ 만으로 pH를 조절하는 공정을 개발하였음. 5L 발효조에서의 회분식배양과 유가식 배양공정을 최적화하였으며 최대 102 g/L의 숙신산 생산성을 확인하였음.
◦ 대용량 숙신산 발효를 위한 스케일업 실험을 수행함. 5L 발효조에서 최적화된 유가식 배양공정을 50L, 500L 급의 발효조에 적용하여 숙신산의 생산 재현성을 확인하였음.
◦ 효율적인 숙신산 분리정제 기술을 개발하기 위하여 산처리 대신 ion-exchange공정을 통해 Mg-succinate를 succinic acid로 전환하여 보다 친환경적인 공정으로 만들기 위한 새로운 공정을 구성함. Decolorization 공정을 최적화하고 회수율을 숙신산 회수율을 향상시키기 위해 다양한 종류의 activated carbon을 테스트하였음. 그 결과 ~90%의 회수율로 순도 99.9%의 숙신산을 회수할 수 있었음.
◦ 숙신산(succinic acid)의 수소화반응을 통한 1,4-부탄다이올(1,4-butanediol, BDO)의 생산공정은 직접수소화 반응경로와 간접수소화 반응경로를 활용하는 연구를 수행하였음. 1단계 연구에서는 BDO를 숙신산의 직접수소화 반응경로를 활용하는 방안을 연구하였으나, 다양한 촉매군의 적용에도 BDO 수율이 40% 이하로 확인되었음. 따라서 BDO 수율을 높이고자 숙신산의 간접수소화 반응경로를 고안하게 되었으며, 해당 경로는 숙신산무수물(succinic anhydride, SAN) 및 감마뷰티로락톤(γ-butyrolactone, GBL)을 경유하는 경로임.
◦ 간접수소화 반응경로를 활용하기 위해, 다음의 두 가지 수소화반응에 대한 연구를 수행하였음: (1) 숙신산무수물(SAN)의 수소화반응을 통한 감마뷰티로락톤(GBL)의 생산, (2) 감마뷰티로락톤(GBL)의 수소화반응을 통한 1,4-부탄다이올(BDO)의 생산에 대한 촉매개발과 관련 연구를 진행하였음.
◦ 숙신산무수물의 수소화반응에 신규촉매인 루테늄 나노입자담지 실리카 촉매(RuNPs/SiO₂)를 적용하였음. 본 과제를 수행함에 있어 새롭게 개발된 RuNPs/SiO₂ 촉매는 해당 수소화 반응에 기존 타그룹의 연구결과보다 우수한 성능을 나타냈으며(GBL 수율 84%), 촉매의 제조법과 반응에 대한 국내특허를 출원 및 SCI 논문의 출판의 실적을 확보하였음.
◦ 감마뷰티로락톤의 수소화반응은 부탄올, 프로판올 등의 부산물이 생성되지 않는 구리-아연계 촉매(CuZnO)를 적용하여 연구를 진행하였음. CuZnO 촉매 내 성분인 Cu:Zn 몰비율에 따른 BDO 수율에 대한 영향을 평가하였으며, CuZnO(40:60) 촉매의 성능이 가장 우수한 것으로 확인되었음. 또한 해당 반응은 고온-고압의 수소화반응임에도 반응평형이 존재하는 것으로 확인되어 열역학적, 반응공학적 고찰을 통해 반응물과 생성물의 농도변화 추이를 예측할 수 있는 기술을 개발하였음.

기술개발 배경
◦ 현재 BDO는 석유화학 원료로부터 전량 생산되고 있으며, 대부분이 아세틸렌(acetylene)과 포름알데하이드(formaldehyde)를 출발물질로 하는 Reppe 프로세스를 통해 생산됨. 하지만, 이 공정의 경우 고온고압의 반응조건을 사용하며 출발물질들의 유해성이 높다는 단점을 가지고 있음.
◦ 또한, 최근 기존의 석유화학 공정에 있어 유가의 상승 및 점진적 고갈이 큰 문제점으로 지적되고 있는 바, 이에 능동적으로 대처하기 위해서는 재생 가능한 천연물질을 원료로하여 화학 중간원료물질을 생산하는 신공정 개발이 반드시 필요한 현실임.
◦ 본 기술개발의 목표는 기존의 석유화학공정을 통해 생산되는 BDO를 천연원료로부터 생산할 수 있는 새로운 공정을 개발하는 것임. 이를 통해 장차 다가올 화석연료 고갈이 화학 산업에 미칠 수 있는 영향을 최소화하고, 현재 제한된 형태로 이루어지고 있는 천연자원의 활용 가능성을 높이며, 환경 유해성 및 에너지 소모가 적은 공정을 개발하고자 함.

핵심개발 기술의 의의
개발하고자 하는 공정이 생물전환공정 및 화학촉매공정을 포괄하는 하이브리드 공정이므로, 바이오촉매 및 발효 공정 개발, 화학촉매 및 화학 전환 공정 개발의 이분화된 수행체계를 기본으로 연결 공정에 해당하는 발효 생산물 분리, 회수 공정의 동시개발을 통해 최종적으로 통합 하이브리드 공정을 구축하여 경쟁력 있는 사업화 가능성이 있음.

적용 분야
하이브리드 공정 구축을 통하여 기존의 석유화학 공정을 대체하여 천연원료로부터 BDO를 생산생산하는 신공정으로 활용 할 수 있음.


(출처 : 기술개발사업 최종보고서 초록)

목차 Contents

• 표지 ... 1제 출 문 ... 2기술개발사업 최종보고서 초록 ... 3기술개발사업 주요 연구성과 ... 28목차 ... 37제 1 장 서론 ... 38 제 1 절 과제의 개요 ... 38제 2 장 과제 수행의 내용 및 결과 ... 40 제 1 절 최종 목표 및 평가 방법 ... 40 제 2 절 단계 목표 및 평가 방법 ... 41 제 3 절 연차별 개발 내용 및 개발 범위 ... 41 제 4 절 수행 결과의 보안등급 ... 51 제 5 절 유형적 발생품(연구시설, 연구장비 등) 구입 및 관리 현황 ... 51제 3 장 결과 및 사업화 계획 ... 52 제 1 절 연구개발 최종 결과 ... 52 1. 연구개발 추진 일정 ... 52 2. 연구개발 추진 실적 ... 53 3. 기술개발 결과의 유형 및 무형 성과 ... 67 제 2 절 연구개발 추진 체계 ... 299 1. 기술개발 추진방법․전략 ... 299 2. 기술개발 추진체계 ... 301 3. 기술개발팀 편성도 ... 301 제 3 절 시장 현황 및 사업화 전망 ... 302 제 4 절 고용 창출 효과 ... 305 제 5 절 자체보안관리진단표 ... 306끝페이지 ... 307