초록 ▼

Ⅳ. 연구 결과
가. 대형챔버법을 이용한 채취 방법(충돌법, 인핀저법, 필터법 등)에 따른 미생물 포집효율 연구
현재까지 황사 등 바이오에로졸 중 미생물 조사를 위한 시료채취, 배양, 유전자분석 등의 방법이 국내외 적으로 표준화되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 바이오에어로졸 미생물 분석을 위한 다양한 방법 중 충돌법, 임핀져법, 필터법 등 세 가지 시료채취 방법에 대한 미생물 포집 효율을 조사하였다. 또한 채취 미생물의 종류를 크기 별로 구분하여 다양한 조건에서 분석하기 위해 항온, 항습장치 및 환기, 배기 장치 등

Ⅳ. 연구 결과
가. 대형챔버법을 이용한 채취 방법(충돌법, 인핀저법, 필터법 등)에 따른 미생물 포집효율 연구
현재까지 황사 등 바이오에로졸 중 미생물 조사를 위한 시료채취, 배양, 유전자분석 등의 방법이 국내외 적으로 표준화되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 바이오에어로졸 미생물 분석을 위한 다양한 방법 중 충돌법, 임핀져법, 필터법 등 세 가지 시료채취 방법에 대한 미생물 포집 효율을 조사하였다. 또한 채취 미생물의 종류를 크기 별로 구분하여 다양한 조건에서 분석하기 위해 항온, 항습장치 및 환기, 배기 장치 등이 구비된 대형챔버를 활용하여 진행하였다.

대형챔버 내에서 미생물 분사 후 채취 효율을 분석한 결과, 충돌법을 사용했을 경우에는 크기가 큰 미생물 채취 시 상대적으로 낮은 효율을 보였으며, 미생물의 농도를 알 수 없는 시료의 경우 채취량을 결정하기 어렵기 때문에 실제 황사 등 바이오에어로졸의 시료채취에는 어려움이 따를 것으로 평가되었다. 임핀져법의 경우는 미생물 크기가 커질수록 채집 농도가 증가하는 것으로 확인되었는데 이는 미생물 포집 시 원심력의 영향으로 상대적으로 가벼운 미생물의 경우 손실이 생겼을 것으로 판단된다. 반면 필터법은 미생물 크기에 관계없이 유사한 채취 농도를 보였으며 콜로니 분석 과정에서 희석 배수에 크게 영향을 받지 않아 다양한 조건이 생길 수 있는 대기 시료 채취에 적합할 것으로 판단되었다.

황사 등 바이오에어로졸에는 다양한 미생물들이 포함될 수 있으며, 국내외 연구 결과에 의하면 호흡기질병 등을 유발하는 미생물도 포함될 수 있는 것으로 알려져 있다 (He et al, 2010, Kim et al, 2003). 앞으로 우리나라의 황사 및 비황사 기간에 이러한 미생물의 분포 특성 및 영향을 조사하기 위해 Bibby 연구진에서 발표한 미생물 목록 (Bibby et al, 2010)과 Airborn pathogen database(US EPA) 및 질병관리본부의 호흡기 질환 미생물 등의 참고자료를 통해 조사가 필요한 대상 미생물 목록을 작성하였다.

나. 황사/비황사 기간 바이오에어로졸 시료채취 및 미생물 유전자 다양성 분석
본 연구에서는 2013년과 2014년, 2015년에 채취된 시료를 이용하여 메타지놈 분석을 통해 미생물학적 유전자 다양성 및 분포 특성을 평가하였다. 2013년 시료의 경우 6개 지역별 대기집중측정소(국립환경과학원) 시료를 제공받아 분석하였으며, 2014년과 2015년은 서울 및 경기지역에서 직접 시료를 채취하여 분석하였다.

황사가 발생했던 2014년 12월에 임핀져법을 이용하여 20 L/min의 유량으로 시료를 채취한 뒤 폴리카보네이트 필터에 농축시켜 분석하였다. 2015년의 경우 2월에서 3월까지 상대적으로 잦은 횟수의 황사가 관측되었으며, 대용량 샘플러를 이용하여 경기지역 및 서울지역에서 700 L/min의 유량으로 시료를 채취하고 황사/비황사 기간을 구분하여 분석하였다.

연구기간 중 고도시료 분석을 위해 세 차례에 걸쳐 항공기를 이용해 임핀져 방법으로 시료를 채취하여 분석하였다. 한 차례는 2014년 11월에 저고도(1 km 및 700 m) 상공에서 시료를 채취하였으며, 두 차례는 2015년 황사기간 중 1∼5 km 사이의 고고도 상공에서 시료를 채취하여 미생물 군집의 유전자 다양성을 비교분석하였다.

2014년 및 2015년 황사 및 비황사 시기의 배양 미생물 분석을 위해서 임팩터 방법으로 시료 채취를 진행하였다. 채취된 시료 내 미생물 군집 수를 황사 및 비황사 기간으로 구분하여 비교 분석을 진행하였으며, 황사 및 비황사 시기에 따른 병원성과 관련된 조사대상 미생물 분포 특성 분석에 활용하였다.

다. NGS, MLST 법 등 차세대 유전자염기서열 분석기법을 이용한 미생물군집 분석
본 연구에서 채취된 시료에 대해 NGS (Next generation sequencing) 분석 및 16S rRNA 유전자 동정을 통한 배양 미생물 군집분석을 진행하였다. 채취된 시료 분석을 위해 분석에 적합한 프라이머 세트 및 NGS 인식 서열을 선정하여 진행하였으며, NGS 데이터는 Mothur, RDP tutorial에 따라 분석을 진행하였다.

1) 2013년 월별 시료 분석
2013년 백령도, 서울, 광주 월별 시료의 경우 11∼20일까지의 시료를 모아 진행되었으며 황사가 유입된 3월과 그 전, 후 기간 동안의 서울 시료는 일별 분석을 진행하였다. 백령도 월별 시료의 경우 황사와 비황사 기간에 관계없이 거의 유사한 군집 분포를 나타내었으며 Sphingomonas 속이 가장 높은 비율로 존재하는 것으로 분석되었으며, 광주 및 서울 지역의 월별 시료 분석 결과도 유사한 경향을 나타내었다. 백령도 및 서울 지역의 경우 황사 기간 동안 Pseudomonas 속이 적게 검출되는 것을 확인할 수 있었으나, 추가 분석 결과 2013년 황사 기간에 특정 미생물 속 (genus)에 대한 뚜렷한 경향성은 찾기가 힘들었다. 2013년의 경우, 황사가 3월 중 3일 동안 유입된 것으로 보고되었지만 2월과 3월에 걸쳐 지속적으로 높은 미세먼지 농도를 보여 월별 시료를 이용한 미생물 군집 분석만으로는 황사에 의한 영향인지 미세먼지에 의한 영향인지의 구분이 어려웠다.

2) 2013년 일별 시료 분석
서울 지역의 2월, 3월 시료를 대상으로 일별 시료 분석을 수행하였다. 조사결과 비황사시기의 일별 시료분석 결과와 비교 하였을 때 황사가 있었던 3월 1일에는 미생물 다양성 지수가 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 황사가 있었던 3월 1일에 Deinococcus 속이 많이 발견됨을 확인할 수 있었으며, 2013년 시료의 경우 전반적으로 황사와 비황사 기간 중 뚜렷한 군집 특성을 확인하기가 어려웠다.

3) 2014년 12월 황사 기간 시료 분석
황사가 있었던 2014년 12월 2일 전, 후로 미생물 군집 분석을 진행하였다. Rarefaction curve 분석 결과 12월 1일과 2일이 12월 3일에 비해 상당히 높은 미생물 다양성 지수를 나타내었으며, 2013년과는 달리 황사 및 비황사기간의 미생물군집 분포 차이가 있었다. 문 (phylum) 수준에서 Proteobacteria가 가장 많이 분포하고 있었으나 12월 1일과 2일의 황사기간 시료에서는 Proteobacteria 외에도 Actinobacteria, Firmicutes, Acidobacteria 순으로 많이 검출되는 것으로 나타나 2014년에는 황사 및 비황사 기간의 미생물 군집에 차이가 있는 것으로 분석되었다.

4) 2015년 경기 및 서울 지역 시료 분석
2015년은 2월, 3월에 걸쳐 9번의 황사가 온 것으로 관측되었다. 전체 시료를 계통분류학적 문(Phylum) 수준에서 분석하였을 때 대체적으로 Proteobacteria가 우점종인 것을 확인할 수 있었으며, 황사 기간에는 Actinobacteria, Firmicutes가 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 속(Genus) 수준에서 군집분석을 실시한 결과 황사 기간에 특별히 증가하는 속(Genus) 들이 있었으며, 이렇게 황사 기간에만 나타나는 미생물들을 정리하여 향후 황사 내 미생물 군집 marker로 사용하고자 하였다.

2015년도 경기 및 서울 지역에서 채취된 시료의 세균 16S rRNA 유전자 정량 분석 결과, 해당 기간의 미세먼지 농도 변화와 유사한 경향성을 보이는 것으로 나타났다. 또한 미세먼지 농도가 높은 황사 기간 시료의 유전자 분석결과 세균의 개체수가 높아지기는 하지만 미세먼지 농도가 낮은 비황사 기간에 비해 질병과 관련이 있는 세균의 유전자는 오히려 낮은 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 한편 2015년에는 비황사 기간에 주로 검출되는 E. coli 가 포함되는 Proteobacteria가 황사 기간에 줄어드는 등 미생물군집의 변화가 있는 것으로 보아 황사기간에 새롭게 유입되는 미생물에 의해 양적인 증가와 함께 군집분포도 변화되고 있는 것으로 사료된다.

5) 항공기 시료 분석
2014년 11월 18일 비황사 기간의 항공기 시료 분석 결과 지상과 고도 시료 (700∼800 m 지점)에서 미생물 군집에 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다. 고고도 및 저고도 시료 모두에서 Sphingomonas가 우점종이지만 이를 제외하면 나머지 상위 속(genus)들은 뚜렷한 차이를 보였다.
2015년 3월 및 4월 황사 기간의 고도별 (1∼5 km 지점) 시료 분석도 함께 진행하였으며, 고도에 따른 차이는 확인할 수 있었으나 각 고도 간의 특별한 상관관계는 찾지 못하였다.

6) 미세먼지 입자 크기에 따른 시료 분석
황사로 보고된 2015년 2월 23일과 비황사 기간인 2월 26일에 High volume cascade impactor를 이용하여 미세먼지 입자 크기별로 시료 채취를 진행하였다. 시료 내 미생물 다양성을 분석한 결과 미세먼지 입자 크기에 따른 차이는 없었으나 시료채취 시기에 따른 차이는 있는 것으로 조사되었다.
통계적 유의성 분석에서도 2015년 2월 23일과 26일 시료 간에는 미생물 군집 차이를 확인 할 수 있었지만 (p＜0.001), 2월 23일 채취한 미세먼지 입자 크기별 시료는 유의한 차이가 없는 것으로 분석되었다 (p＞0.05).

7) 배양 미생물 분석
2014년 11월, 12월과 2015년 3월까지 임팩터를 이용하여 황사 및 비황사 기간의 배양성 미생물 시료 채취를 진행하였다. 채취된 배양 미생물 정량 결과, 황사 및 비황사 기간 모두 Bacillus 속이 가장 많은 비율로 존재하였으며, 황사 기간에 보다 많은 수의 미생물이 존재하는 것으로 조사되었다.
한편 Bacillus cereus 그룹에 대한 MLST (Multilocus sequence typing)분석 결과, 황사 및 비황사 기간에 서로 다른 유전자 서열 타입을 가지는 Bacillus 속들이 분석되어 차이가 있는 것으로 나타났으며, 추가적으로 혈청 분석, 항생제 (peptide)내성, 운동성 (motility) 및 생물막 형성 등 다양한 분석을 통해 미생물 군집 내 간접적으로 미생물의 유해가능성을 평가한 결과 황사 기간 발견된 미생물에서 비교적 높은 운동성을 가지는 것으로 확인되었을 뿐 황사 및 비황사 기간이 대체적으로 유사한 결과를 보였다.

라. 발원지 및 유입경로에 따른 시료 분석
2015년 경기 지역 시료에 대해 황사 발원지 및 유입 경로에 따른 미생물 군집 차이를 분석하였다. 이를 위해 HYSPLIT 모델을 이용하여 2015년 2월과 3월의 황사 기간 유입 경로에 대해 역궤적 분석을 진행하였으며 미국 NCEP 기상 예측 모델인 GDAS (global data assimilation system)을 활용하였다 (주요 발원지는 만주, 내몽골, 황토지역, 유입경로는 육지 또는 바다로 구분). 분석 결과 총 9 차례의 황사 기간 중 만주 4회, 내몽골 4회, 황토 1회로 확인되었으며, 대부분이 바다를 통해 유입되었다. 각 기간에 따른 미생물 군집 분석 결과, 발원지 및 유입 경로 모두에 따라 유의성 있는 차이를 보였으며 특히 유입 경로에 따른 차이를 확인할 수 있었다. 만주지역으로부터 발원한 4회의 황사 기간을 분석한 결과, 동일한 발원지로부터 유입되었음에도 불구하고 육지 또는 바다를 통한 유입 경로에 따라 미생물 군집 구성에 차이가 있는 것으로 분석되었다.

(출처 : 요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• 목차 ... 10
• 표목차 ... 12
• 그림목차 ... 14
• 제 1장. 서 론 ... 19
• 1. 연구의 배경 및 필요성 ... 19
• 2. 연구의 목적 ... 23
• 3. 연구 추진 체계 ... 25
• 4. 연구 기관간의 연구 내용 및 조직도 ... 26
• 제 2장. 연구내용 및 방법 ... 27
• 제 1절. 연구 범위 ... 27
• 제 2절. 연구 내용 및 방법 ... 28
• 1. 대형챔버를 이용한 채취방법 (충돌법, 임핀저법, 필터법 등)에 따른 미생물 포집효율 연구 ... 28
• 2. 관리/조사대상 미생물 목록 작성 ... 29
• 3. NGS, MLST 법 등 최신 분자생물학적 기법을 활용한 미생물 군집 분석 연구 ... 29
• 4. 황사/비황사 기간의 바이오에어로졸 모니터링 ... 30
• 5. 황사 발생 시 비행기를 이용한 고고도 및 저고도 시료 모니터링 ... 30
• 6. 황사 및 비황사 기간의 미생물 군집 중 Bacillus 그룹의 유전학적 다양성 및 유해성 평가 ... 33
• 7. 황사 발원지 특성에 따른 미생물 분포 특성 연구 ... 33
• 제 3장. 연구결과 및 고찰 ... 35
• 제 1절. 바이오에어로졸 내 미생물 채취 및 분석방법 연구 ... 35
• 1. 관리/조사대상 미생물 목록 작성 ... 35
• 2. 대형 챔버를 이용한 채취방법(충돌법, 임핀져법, 필터법 등)에 따른 미생물 포집효율 연구 ... 38
• 3. NGS, MLST 법 등 최신 분자생물학적 기법을 활용한 미생물 군집 분석 연구 ... 50
• 제 2절. 황사/비황사 기간 및 지역별, 고도별 바이오에어로졸 오염 모니터링 ... 68
• 1. 황사/비황사 기간의 바이오에어로졸 시료 채취 및 분석 ... 69
• 2. 황사 발생 시 비행기를 이용한 고고도 시료 및 저고도 시료 채취 및 분석 ... 109
• 3. 미세먼지 입자 크기별 미생물 군집 분석 ... 116
• 4. 시료 채취 필터 내 LIVE/DEAD 미생물 구분 ... 119
• 5. 필터 내 미생물의 관찰 ... 121
• 제 3절. 황사의 위해성 평가방안 마련을 위한 영향 분석 ... 122
• 1. 조사 대상 미생물 분석 ... 123
• 2. 배양 미생물 병원성 평가 ... 126
• 3. 황사의 발원지 및 유입경로에 따른 미생물 군집 변화 ... 143
• 제 4장. 결 론 ... 150
• 제 5장. 기대성과 (활용방안) 또는 향후 계획 ... 152
• 제 6장. 참고문헌 ... 153
• 끝페이지 ... 156