보고서 정보
주관연구기관 |
대한환경공학회 |
연구책임자 |
박준홍
|
참여연구자 |
유근제
,
이재진
,
유병은
,
고관수
,
최지영
,
김대훈
,
임영운
,
이현
,
이강운
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2012-11 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
환경부 Ministry of Environment |
등록번호 |
TRKO201700008233 |
과제고유번호 |
1485010846 |
사업명 |
지구환경조사연구 |
DB 구축일자 |
2017-10-12
|
초록
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Ⅲ. 연구결과
가. 바이오에어로졸 내 병원성 세균 표준 검측 방법의 최적화
(1) 샘플링 및 실험개요
- 본 연구에서 사용하는 차세대 염기서열기법(Next Generation Sequencing;NGS)은 분석 목표 유전자의 PCR 증폭과 이를 pyrosequencing하는 방법임. 본연구에서는 발생하는 error를 최소화하기 위해서, RDP에서 기존에 제공하는 분석 도구에 error를 교정하는 Ampliconnoise 프로그램을 추가 이용하는 방법으로 개선함. 특히 학술목적으로 무상 공급되는 Amplicon
Ⅲ. 연구결과
가. 바이오에어로졸 내 병원성 세균 표준 검측 방법의 최적화
(1) 샘플링 및 실험개요
- 본 연구에서 사용하는 차세대 염기서열기법(Next Generation Sequencing;NGS)은 분석 목표 유전자의 PCR 증폭과 이를 pyrosequencing하는 방법임. 본연구에서는 발생하는 error를 최소화하기 위해서, RDP에서 기존에 제공하는 분석 도구에 error를 교정하는 Ampliconnoise 프로그램을 추가 이용하는 방법으로 개선함. 특히 학술목적으로 무상 공급되는 Ampliconnoise의 느린 계산 속도를 30배 정도 향상되도록 하였으며, 이는 다량의 환경시료 내 염기서열분석 사용에 적절하게 활용이 가능함.
- 개선된 pyrosequencing 방법을 이용하여, 서울시 바이오에어로졸 미생물군집 변화를 계절별, 시간별 모니터링 하여서, 그 방법의 환경 내 바이오에어로졸 미생물 분석 적용성을 평가함. 이를 위해서 4월, 5월, 6월, 7월, 8월, 9월에 서울시 신촌 지역에서 샘플링을 실시하였고, 2011년에 불광동 지역에서 분석한 결과와 비교 분석하였음.
- 황사 주요 발원지인 Gobi 사막 인근 지역 토양의 박테리아가 한반도로 이동한지를 파악하기 위해서, Nomgon과 Erdene 지역의 토양을 획득 (서울대학교 대기환경모델링센터 [박순웅 센터장]), 박테리아 군집 분석을 같은 NGS 방법으로 수행함. 금년도의 경우 국내에 황사가 발생하지 않았고, 작년의 경우에는 황사기간에 분석된 박테리아 군집 결과를 보유하고 있으므로, 황사 주요발원지의 박테리아 군집과 황사와 비황사 기간의 국내 바이오에어로졸 간의 상관성을 비교분석함.
(2) 서울시 바이오에어로졸 박테리아 군집의 계절적, 위치별 비교분석
- 2012년도 서울시 신촌동 대기 내 미생물 군집에서 Bacillus 속에 속하는 세균이 지속적으로 우점하고 있는 것을 파악함. 하지만 봄철 (4월, 5월)과 여름철 (6월-9월) 사이에 미생물군집내 타 우점종 구성원 조성에 차이가 있는 것으로 나타났으므로, 서울시 바이오에어로졸 미생물 군집은 계절별로 상이함을 나타냄.
- 유사한 계절인 4월-5월에 서울시내에 다른 두 지역 (불광동, 신촌)의 바이오에어로졸 미생물군집을 비교한 결과, 동일한 서대문구 지역이지만, 위치와 주변 환경에 따라서 박테리아 군집 구성에 차이가 있었음 <그림 1>. 이는 도심의 바이오 에어로졸 내 미생물 유해성 평가 시 시료채취는 계절별로, 같은 행정 구역 내에서도 지역별로 이루어져야 함을 시사함.
- 그럼에도 불구하고, 황사기간의 박테리아 군집은 타 기간에 비해서 현격하게 다르고, 이는 시료 채취 위치의 차이에 대한 영향보다 더 크게 나타남 <그림 2>. PCA (principal component analysis) 분석결과, 황사기간의 박테리아 군집 특성은 PM10의 증가와 상관성이 있는 것으로 나타남.
(3) 주요 황사발원지 토양과 서울시 바이오에어로졸 박테리아군집 비교
- 고비사막 인근 지역인 Nomgon area와 Erdene area의 토양 미생물 군집 분석 결과 Segetibacter, Flavisolibacter, Bacillus 속이 우점종인 것으로 나타났으며, 주로 토양에서 발견되는 미생물 임. 고비사막 인근 지역에서 검측된 미생물들은 대부분 Bacteroidetes group (phylum level)에 속하는 미생물들 이었으며, 주로 gram negative bacteria에 속하는 호기성 미생물인 것으로 나타남. 이는 2012년 황사가 없었던 시기의 서울시 바이오에어로졸 박테리아 군집과는 통계적으로 차이가 있으나, 2011년 황사 기간에 측정된 박테리아 군집 중 일부와 유사한 세균으로 추측됨.
- 고비 사막에서 우점종으로 나타난 bacillus group이 2011년도 황사기간에 내몽고 지역 및 고비 사막에서부터 국내까지 운송된 미생물들과 유사성이 높은지 알아보기 위해 16S rRNA에 기반한 phylogenetic tree (계통학적 트리) 분석을 실시함. 16S rRNA 기반의 계통학적 트리 분석 결과 Asian dust cluster 1과 2는 Gobi cluster 6와 매우 유사함을 확인할 수 있었음 <그림 3>.
- 본 연구진과 국제 협력을 통한 네트워킹을 구축하고 있는 일본의 Dr. Nasu 연구진(Osaka university)에서 황사 발생일인 2011년도 5월 4일 일본 해양에서 항공샘플링을 통해 미생물 군집을 분석한 결과 주요 미생물 군집은 Bacilli, Actinobacteria, Sphingobacteria (Class level)이고, 2011년도에 본 연구진에서 황사기간에 분석한 박테리아 군집 구성과 유사하며, 일부 Bacillus 는 상당히 유사한 것이 일본의 경우와 동일하게 검측됨.
- 이는 고비 사막에서 황사 기간에 불어온 미생물들이 서울을 거쳐 일본까지 장거리 이동하였을 가능성을 시사하고, 동시에 한국에서 검출된 Bacillus 계통의 세균들이 황사에 의해서 서울시 바이오에어로졸내 유입될 개연성이 매우 높다는 것을 의미함. 추후에 황사 시료의 확충과, 발원지로부터의 이동 경로의 직접 시료채취를 통한 다면 직접적인 원인-결과 관계 규명이 가능할 것임.
(4) Multiple-gene-amplicon-pyrosequencing 활용한 병원성 유해성 진단
- 미생물학적으로 16S rRNA gene이 염기서열만으로는 검출된 세균이 병원성인지를 밝히는 것은 불가능하지만, 병원성 세균으로 알려진 속 (genus)에 속하는 OTUs가 많으면 병원성 세균일 가능성이 높을 것으로 추정되므로(Han et al., 2012), 이 원리를 이용해서 병원성 유해정도를 16S rRNA gene amplicon을 pyrosequencing한 결과를 이용해서 평가하는 방안에 대해서 연구함.
- 한일 등의 방법 (Han et al., 2012)에 따라서 양질의 염기서열 중에서 알려진 병원성세균이 속한 속으로 판별되는 퍼센트를 산정한 결과 <표 1>, 비황사기간 바이오에어로졸과 고비사막 토양에 비해 황사기간의 바이오에어로졸 시료에서 병원균 포함 속으로 판별되는 염기서열의 수가 통계적으로 높게 나타남 <표 1>. 이 결과들은 황사기간의 바이오에어로졸내 박테리아 유해도가 비황사기간 바이오에어로졸과 추측발원지의 그것보다 크다는 점을 시사함.
- 황사기간에 바이오에어로졸에서 Bacillus, Neisseria, Shigella가 주요 속으로 판명되었음. 이 중에서 Bacillus 속에 속하는 박테리아가 일부 고비사막의 토양에서도 상대적으로 높게 산정되었으나, Neisseria와 Shigella는 고비사막 토양에서 발견되지 않았음 <표 1>. 이는 황사기간에 증가된 박테리아 유해도는 추측 발원지의 세균 유입과 그 외의 원인이 혼합되었을 가능성이 높음을 제시함.
- 상기 16S rRNA 유전자 기반으로 병원성 유해도 산정하는 방법을 검증하기 위해서, Bacillus cereus group 내 병원성 유전자인 bceT gene을 검측 할 수 있는 bio-marker (bceT gene) 이용해서 정량적 PCR 분석을 하였음 <그림 4>. 그 결과, 황사기간에 비황사기간에 비해서 현격하게 바이오에어로졸내에 bceT gene copy 수가 증가함을 알 수 있어서, 상기 16S rRNA 유전자 기반으로 산정한 병원성 유해도가 유의함을 보임.
(5) 바이오에어로졸 bacteria inventory 구축
- 2011년도와 2012년도에 NGS 방법으로 2011년도 서울 불광동과 2012년도 신촌동에서 획득한 서울시내 바이오에어로졸 세균 16S rRNA 염기서열수는 총 248,356 이며, 2012년도에 고비 사막에서 획득한 16S rRNA 염기서열수는 총 116,437 임. 이중 2011년도 황사기간에만 획득한 16S rRNA 염기서열수는 27,561이며, 전체 16S rRNA 염기서열 중 약 10% 는 신규 세균인 것으로 나타남 <그림 5>.
나. 배양성 병원성 세균 표준 검측 방법을 이용한 바이오에어로졸 내 병원성 유해성 분석
(1) 실험개요
- NGS 기반의 16S rRNA 유전자 염기서열방법으로 스크린 한 바이오에어로졸내 황사 특이 병원성 세균 후보 (Bacillus cereus group) 에 대해서 strain 수준의 동정을 해야 할 필요가 있음. 이를 위해서 배양분리를 한 세균에 대해서 multi-locus sequencing typing (MLST) 을 실시하였음.
- 2012년도 4월부터 9월 까지 비황사 기간에 서울시 신촌동에서 샘플링을 실시하여 서울시 대기 미생물 샘플을 확보하였으며, 고비사막 인근 지역의 토양 샘플도 8개 확보하여 배양방법을 통한 종 동정으로 병원성 미생물 분석을 실시함.
(2) MLST 분석
- Multilocus sequence typing (MLST) 분석을 위해 B. cereus group (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis)을 선택하였고, 위 세 가지 종을 대상으로 glp 등 7개 유전자 염기서열 MLST 분석한 결과 16S rRNA 염기서열 근거로 B. anthracis 로 판별된 strain ST223이 사실은 B. cereus 로 최종 판별되었음. 따라서 amplicon pyrosequencing을 통해서 황사 특이 병원성 세균으로 추정되었던 B. cereus 가 MLST 방법으로 확인되었음 <그림 6>.
(3) NGS-MLST-qPCR 활용한 바이오에어로졸 박테리아 유해도 진단 절차
- 본 연구에서 연구된 결과에 근거해서 바이오에어로졸 박테리아의 병원성 유해도를 진단하는 절차를 다음과 같이 수립함. 유해도 진단을 위한 항목들의 정량적 기준치에 대해서는 추후 연구가 필요하지만, 본 연구의 성과를 통해서 NGS-MLST-qPCR 활용해서 바이오에어로졸 박테리아 유해도 진단하는 절차에 체계 수립 실적 <표 2>.
다. 바이오에어로졸 내 곰팡이 표준 검측 방법 제시
(1) 샘플링 및 실험개요
- 당해연도인 2012년도에는 황사가 거의 없어 한국 서울시의 대기 샘플 (서울 신촌동)과 고비사막의 토양샘플 (Erdene area, Nomgon area)을 획득하여 DNA를 추출함. 곰팡이 검측을 위해 염기서열이 보존된 지역과 변이가 높은 지역으로 나뉘어 있어 종(species)수준의 동정, 속(genus)수준의 동정, 과(family)이상의 동정으로 유용하게 쓰일 수 있는 28S rDNA의 D1/2 영역을 선택함. 28S rDNA 영역 Pyrosequencing을 통해 곰팡이 염기서열 정보를 획득하였고, 이를 통해 군집 분석을 실시함.
(2) 서울시 바이오에어로졸 NGS 분석
- 2012년 4월 21일, 5월 4일, 5월 30일 샘플들의 군집 분석한 결과 대부분 자낭균(Ascomycota)인 것으로 확인됨. 담자균(Basidiodiomycota)은 약 10-20% 정도인 것으로 나타났으며, 적은수의 접합균(Zygomycota)이 확인됨. 5월 30일 샘플의 경우 자낭균, 담자균, 접합균 외 병꼴균류(Chytridiomycota)가 확인됨.
- 2012년 4월 28일 샘플에서는 4월 21일, 5월 4일, 5월 30일 샘플들과 달리 담자균(Basidiodiomycota)이 자낭균(Ascomycota) 보다 높은 분포를 이루고 있는 것이 확인 되었으며, 아주 적은수의 접합균(Zygomycota)이 역시 확인되었음.
(3) 고비사막 토양샘플 NGS 분석
- Nomgon Town 샘플의 염기서열 분석 결과 자낭균, 담자균 및 일부 접합균, 병꼴균 및 Glomeromycota등으로 확인되었음. Nomgon Town의 Outside 샘플에서는 자낭균, 담자균 및 일부 접한균, 병꼴균, Rozella 및 Glomeromycota 등이 분포하고 있는 것으로 확인되었음.
- Erdene Town 샘플의 염기서열 분석 결과 자낭균, 담자균과 일부 접한균, 병꼴균, Blastocladiomycota 및 Glomeromycota등으로 확인되었으나 다른 고비사막의 샘플들에 비해 자낭균의 비율이 각 96%, 99%, 99%로 상당히 높았음.
(4) 황사시기 공기 중 주요 곰팡이의 기원
- 4월과 5월의 서울시내 공기중에서 pyrosequencing에 의해 확인된 주요 곰팡이는 자낭균인 Davidiella tassiana, Phoma herbarum, Alternaria로 이들은 전세계 어디서나 흔희 발견되는 곰팡이로 알려져 있음. 식물병원성균으로도 밝혀졌고 또 인간에게 알레르기를 유발하는 곰팡이로도 잘 알려져 있음.
- 담자균의 경우 우점인 Agaricomycetes의 Epithele lutea와 Fomitopsidaceae의 종은 목재부후균으로 겨우내 자란 자실체로부터 봄철 건조해지면서 포자가 날린 것으로 해석할 수 있음. 그러나 Psathyrella의 경우 부생균으로 장마시기나 초여름이 되어야 자실체를 형성하나 이른 봄에 공기중에서 높은 비율 확인된 것은 흥미로운 결과인 듯함.
- 서울 공기중에서와 고비사막에서 공통적으로 확인된 주요 곰팡이는 Phoma herbarum와 Alternaria로 현재 확인된 Phoma herbarum는 모두 Phoma herbarum DQ6708066과 매치되며 이들의 염기서열 유사도는 97%이상으로 확인되었음.
- Alternaria는 Alternaria DQ6708068과 매치되며 이들의 유사도는 97.07%이상으로 확인되었음 <그림 7>. 금년도에는 황사도 없었고 이들은 전세계 어디서나 흔희 볼 수 있는 종으로 한반도 상공에 있는 것이 황사에 의해 중국이나 몽고에서 왔다고 현단계에서는 결론지을 수는 없음. 추후에 중국, 몽고사막지역의 이들 곰팡이를 분리하여 유전적 차이를 확인해야 기원을 규명할 수 있을 것임.
라. 국내외 학술활동
(1) 국제 바이오에어로졸 심포지엄 개최
- 바이오에어로졸 내 위해성 평가의 신뢰성을 확보하고 국제적 네트워크를 결성하기 위해, 국내외 미생물 관련 전문가 워크샾인 2012 International Bioaerosol Symposium을 서울 Standford Hotel (Grand Ballroom A)에서 5월 16일에 개최함.
- 이번 심포지엄에서는 바이오에어로졸 및 황사 연구의 최신 연구 동향 및 기술 등을 습득하고, 국제적 교류를 위한 기반을 마련하기 위해 미생물 생태 분야, 미생물 위해성 평가 분야, Aeorosol 분야, Sampling 분야, 황사 연구 분야 등 국내외 전문가 및 정부, 대학, 연구소 관련자들을 초청함 <그림 8>.
(2) 국제 네트워킹 그룹 형성
- 본 연구진에서는 최근의 바이오에어로졸 연구기술 현황 및 관련 연구 현황을 신속히 파악하기 위해 미생물 생태분야, 미생물 위해성 평가 분야, 샘플링 분야, 중국 토양환경 분야, 아시아 황사 연구 분야, Aerosol 분야, 병원성 미생물 검측 분야, Virus 검측 분야, Fungi 검측 분야의 국내외 전문가들과 활발히 교류중임.
(3) 국외 학술지 투고
- 현재 까지 진행된 연구 결과를 통해 국외 학술지에 논문을 투고할 계획을 가지고 있음. NGS를 이용한 미생물 군집 분석 표준화 및 배양 방법 기반의 MLST 방법을 통한 병원성 미생물 검측 방법에 대해 논문을 작성할 계획이며, 2011년도와 2012년도 황사/비황사 연구를 통해 도출된 연구결과를 활용할 것임.
(출처 : 요 약 문 5p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 4
- 목차 ... 17
- 표목차 ... 18
- 그림목차 ... 19
- 제1장. 서 론 ... 21
- 가. 사업추진 배경 및 필요성 ... 21
- 나. 사업목표 및 범위 ... 24
- 1. 총괄 연구 목표 ... 24
- 2. 세부 사업 목표 및 연구범위 ... 24
- 다. 연구 추진체계 ... 25
- 제2장. 연구 수행 방법 및 결과 ... 26
- 2.1 연구 수행 방법 ... 26
- 2.2 연구 수행 결과 ... 28
- 가. 바이오에어로졸 내 병원성 미생물 표준 검측 방법의 최적화 ... 28
- 나. 병원성 세균 표준 검측 방법을 이용한 바이오에어로졸 내 병원성 미생물분석 ... 69
- 다. 바이오에어로졸 내 곰팡이 표준 검측 방법 제시 ... 80
- 라. 국내외 학술활동 ... 109
- 2.3 연구 개발 목표의 달성도 ... 120
- 2.4 연구 성과 ... 121
- 제4장. 참고문헌 ... 122
- 끝페이지 ... 126
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