초록 ▼

Ⅲ. 연구결과
가. 바이오에어로졸 내 시료채취 최적화 방법 제시
본 연구에서는 바이오에어로졸 시료 채취 시 고려해야 하는 방법의 최적화 방안을 연구 목적에 따라 제안하였다.

미생물 전체 군집분석 혹은 소수의 병원성 의심 미생물 스크린을 목적으로 하는 경우는 Filtration 방법이 최적인 것으로 파악되었다. 본 연구에서 평가된 시스템은 TSP High Volume Air Sampler 5000이었고, 미생물 포집량과 DNA 추출량이 최대가 되도록 (i) filter, (ii) 시료 채취 시간, (iii) 유

Ⅲ. 연구결과
가. 바이오에어로졸 내 시료채취 최적화 방법 제시
본 연구에서는 바이오에어로졸 시료 채취 시 고려해야 하는 방법의 최적화 방안을 연구 목적에 따라 제안하였다.

미생물 전체 군집분석 혹은 소수의 병원성 의심 미생물 스크린을 목적으로 하는 경우는 Filtration 방법이 최적인 것으로 파악되었다. 본 연구에서 평가된 시스템은 TSP High Volume Air Sampler 5000이었고, 미생물 포집량과 DNA 추출량이 최대가 되도록 (i) filter, (ii) 시료 채취 시간, (iii) 유입 대기 유량 등을 최적화하였다. 그 결과 filter는 track-etched membrane (polycarbonate), 유기 대기용량은 0.6~0.7 Nm³/min, 시료채취 시간은 24 시간으로 Filtration 시료채취 방법을 최적화하였다. 더불어 바이오에어로졸 내 PM10 측정치에 따라서 최적 시료채취 시간을 보정하는 공식을 본 연구에서 개발하였다. 이러한 최적화 결과들을 사용자들이 용이하게 활용할 수 있도록 별도의 지침서를 제작하였다.

대기 바이오에어로졸 내 살아있는 활성 미생물 분석을 목적으로 하는 경우, PMA(propidium monoazide) 전처리를 이용한 Impinger 방법을 본 연구에서는 권장하였다. Impinger 방법의 최적화 연구는 (i) 액체배지의 종류, (ii) 시료 채취시간, (iii) 유입 대기 유량 등을 고려했고, 그 결과 액체배지는 20ml의 Pepton Broth를, 유입 대기 유량으로는 12.5 NL/min를, 시료채취 시간은 30분으로 최적화하였다.

나. Pyrosequencing을 이용한 미생물 군집 분석 최적화
본 연구에서는 바이오에어로졸 시료에서 Pyrosequencing을 활용하여 박테리아 및 진균의 군집 분석을 수행하는 방법에 대한 최적화를 수행하고, 그 결과로 지침을 제시하였다. Pyrosequencing 준비 단계에서는 미생물 군집 분석과 활성 미생물 검측을 위한 전처리 방법 및 DNA 추출 방법, 적정 유전자 증폭 부위 선정, barcode 및 adaptor를 포함한 primer 설계, PCR 증폭 및 정제, 다량의 시료분석을 위한 pooling 과정에 대해서 문헌조사와 실험 결과를 토대로 최적 조건을 도출하여 지침을 제시하였다. 기존 연구들과 핵심적인 차별성은 Pyrosequencing된 염기서열의 신뢰성과 정확성 제고이다. 이를 위해서 염기서열정보를 알고 있는 박테리아들의 복합 유전체(mock community)를 이용해서 염기서열 오류를 직접적으로 측정하는 방식으로 염기서열 정확성 및 신뢰성 제고 방안들을 평가하면서 최적화하였다. Pyrosequencing에서 오류를 제거하고 확보된 양질의 염기서열에서 미생물 군집분석을 위한 전 처리 단계 (align, clustering, OTU)와 다양한 군집분석 방법 (α-다양성, β-다양성, 군집 구성), 미생물 동정에 대해서 상세한 방법상의 지침을 토의하고 제시하였다. 이 결과들과 본 연구에서 도출될 사용자들에게 유용한 지침들을 정리해서 지침서에 포함하였다.

다. 황사 바이오에어로졸 시계열 연구
바이오에어로졸의 3년간의 시계열 모니터링 연구를 통하여 PM10 측정치가 바이오에어로졸의 박테리아 수, 다양성 및 군집 구성에 대한 진단 지표로 활용될 수 있음을 도출하였다. 만약 추후에 PM10 측정치가 미생물 유해도와 유의적 상관성이 확인된다면, PM10 측정치를 이용한 황사의 미생물 유해도 진단도 가능할 것이다. 이에 대한 추가 연구의 필요성이 본 연구에서 도출되었다.

바이오에어로졸의 3년간 시계열 모니터링을 통해서, 황사 특이 박테리아 속으로 판명된 개체들이 규명되었다. 이들은 주로 토양 환경에서 서식하는 박테리아로서 Bacillus, Neisseria, Escherichia, Massilia, Nocardioides 계열의 개체들임이 확인되었다. 이들은 황사 특이 박테리아의 목록으로 정리되었고, 그 유해도 진단은 본 연구의 후반에서 더 심층적으로 다루어졌다.

본 연구 사업에서 구축, 최적화 및 지침화한 바이오에어로졸 시료채취 및 미생물 (박테리아, 진균) 검측 방법을 이용해서 시계열 모니터링을 수행한 연구사례가 도출되었다. 그 성과로서 황사 특이 미생물 정보를 획득하였다. 이 연구결과의 황사 연관성에 대한 검증을 위해서 황사 발원지에서 황사 특이 박테리아가 원거리 이동할 가능성에 대해서 발원지 토양 내 박테리아, 대기 미세입자 역궤적, 황사 기간에 채취된 바이오에 어로졸 박테리아 서식지 역추적 조사를 수행하였고, 그 결과 발원지에서의 황사 특이 박테리아의 원거리 이동 가능성이 매우 높은 것으로 파악되었다. 따라서 이 사례연구의 결과를 통해서 황사 특이 박테리아 정보를 도출하는 바이오에어로졸 시계열 모니터링 방법이 실증화되는 성과를 얻었다.

진균 군집의 경우 2년간의 시계열 분석 결과, 황사/비황사 시료 간 종 구성의 차이가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 박테리아 결과와 상반되는 결과이다. 이러한 현상은 시간적 영향이 바이오에어로졸 내 진균 군집에 미치는 영향이 크다는 것을 시사하지만, 단기적인 모니터링만으로는 충분한 결론을 도출하기에 한계점이 있으므로 박테리아의 경우와 같이 최소 3년 이상의 모니터링 조사를 통한 심층적 연구가 추후에 필요하다.

라. 시료채취 지점 수 및 위치선정에 대한 기초연구
시료채취의 지역의 위치적 차이가 시간적 혹은 대기 환경적 차이보다 바이오에어로졸 미생물 군집에 민감하게 영향을 줄 수 있는 것으로 본 연구에서 나타났다. 또한 시료채취 고도에 따른 영향도 상당한 것으로 파악되었다. 따라서 추후 전국적인 바이오에어로졸 미생물 모니터링을 위해서는 시료 채취의 지역적 위치 및 고도, 그리고 대표성 있는 시료 채취를 위한 최소 시료의 수 등에 관련한 연구가 선행될 필요가 있다. 또한 내륙의 황사의 영향과 비교하기 위해 배경 지역바이오에어로졸로 미생물 분석을 위해서는, 황사의 영향이 적고 대기 환경이 청정한 해양성 기후의 제주도 지역이 적절할 것임이 본 연구의 실험 결과를 통해서 제안되었다.

마. 황사 등 바이오에어로졸 내 박테리아 유해도 분석
1) 16S rRNA 유전자 염기서열 기반 병원성 의심 박테리아 스크리닝
2011년도부터 2013년도까지 Pyrosequencing을 통해 확보한 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 병원성 의심 박테리아를 스크린 한 결과 Bacillus 속과 관련된 병원성 의심 박테리아의 검측 빈도가 높았다.

2) 배양 기반의 병원성 의심 박테리아 동정 및 독성 분석
황사 기간에는 전체 15 종(species)을 동정할 수 있었으며, 이 중 기존에 병원성 박테리아로 알려진 종들은 Bacillus 속에 속하는 것들로 B. cereus group,B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. infantis가 분리되었다. 비황사 기간에는 전체 49종(species)을 동정할 수 있었으며, 그 중 기지의 병원성 박테리아들이 포함된 종들은 Bacillus 속의 B. cereus group, B. megaterium, B. licheniformis,B. amyloliquefaciens, B. mycoides, B. pumilus, B. infantis 등이었다. 그 밖에 Acinetobacter sp. 와 Arthrobacter oxydans도 분리되었다.

황사 기간과 비황사 기간에 분리된 B. cereus 균주의 genotype별 병원성질병 발생 지역과 분리 위치를 MLST DB에서 검토하였다. 검토 결과 대체로 B.cereus group의 균주는 매우 다양한 genotype을 가지며, 대부분이 지금까지는 보고되지 않은 genotype들이었으나, 황사 기간에 분리된 일부 균주들의 genotype은 타 대륙 등에서 보고되었던 것과 동일한 genotype 또는 그것과 유사하였다.
MLST 분석을 통해 대체적으로 황사 기간과 비황사 기간의 균주들은 동일한 균주들이 아닌 것으로 판단할 수 있었다.

황사 기간과 비황사 기간에 분리된 B. cereus group 박테리아에 대하여 entero toxicity assay, motility, biofilm 형성능, polymyxin B (peptide)에 대한 저항성 등의 virulence (독성) 평가를 하였다. Entero toxicity 분석 결과, 황사 기간의 B. cereus group 균주들(평균 86.53%)이 비황사 기간의 균주들(평균 63.59%)에 비해 일반적으로 enterotoxin gene들을 많이 가지고 있는 것을 확인 할 수 있었다. Motility 분석을 실시한 결과, 비황사 기간의 균주들에 대해서는 80.4%, 황사 기간의 균주들에 대해서는 81.3%로 현격한 차이가 없었다. Biofilm 형성 비교한 결과, 황사 기간의 균주들과 비황사 기간 균주들 사이에 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. Polymyxin B (peptide) 저항성분석 결과, 황사 기간 균주들과 비황사 기간 균주들 사이에 유의미한 차이는 없었으나, 연도별로는 뚜렷한 차이가 있는 것으로 나타나났다 (2011년도: 평균 51.3%, 2012년도: 평균 61.3%,2013년도: 평균 50.7%).

이러한 연구 결과를 통해 B. cereus group의 병원성이 시기별로 차이가 있는 것을 파악할 수 있었다. B. cereus group 이외의 병원성 박테리아의 polymyxin B 저항성 분석 결과, B. licheniformis와 B. mycoides 개체는 B. cereus group의 균주들과 비슷한 정도의 저항성을 가지고 있었다. 따라서 B. cereus group 이외에 B. licheniformis와 B. mycoides 개체도 주목해야할 병원성 의심 박테리아 종으로 판단된다.

MLST와 virulence 평가 결과 16S rRNA 유전자 염기서열에 근거해서 스크리닝된 병원성 의심 박테리아 중 B. cereus group, B. licheniformis, B.mycoides와 같은 일부 박테리아는 병원성 박테리아일 가능성이 매우 높은 것으로 파악되었다. 비록 황사 기간과 비황사 기간별로 병원성 박테리아가 구분되지는 않았지만, 황사 기간에 검측된 몇몇 병원성 의심 박테리아는 비황사 기간에 검측된 병원성 의심 박테리아와 strain이 다른 것으로 나타났다. 이는 시계열 연구에서 도출된 결과와 마찬가지로 황사 기간의 박테리아가 외부에서 유입되었을 가능성이 높음을 시사한다.

3) 기능성 유전자를 이용한 병원성 박테리아 판단 연구
2011년도부터 2013년도까지 B. cereus 종의 병원성 박테리아가 가지고 있는 장 관련 질환 유해성 유전자인 bceT의 정량적 양을 분석한 결과, 연도별로 정량적 차이가 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 황사 등 바이오에어로 졸 특이 병원성 박테리아 검측을 위한 바이오마커로 B. cereus의 bceT 유전자를 제안한다. 한편 DNA 복제에 관여하는 gyrase 효소인 gyrB 유전자를 이용하여 분석한 결과 B. mycoides, Acinetobacter 종 등과 같은 병원성 의심 박테리아 종들로 파악되었다.

4) 질병발생 자료와의 통계적 상관성 분석
바이오에어로졸의 위해성을 확인하기 위하여, 역학 연구를 통해 용량-반응 함수유도에 필요한 비례위험도를 산출하였다. 측정된 날짜의 바이오에어로졸 농도를 독립변수로, 천식 또는 기능성 장 질환 응급실 내원의 일일 건수를 종속변수로, 요일 및 휴일,기온, 습도 등을 혼란변수로 하여 프아송 회귀 (Poisson regression) 분석을 시행하였고,분석 결과, 응급실 방문 4-6일 전의 총 바이오에어로졸의 노출(흡입)에 대해 박테리아 1,000,000 copies/m³ 증가 당 최고 12%만큼 천식으로 인한 응급실 방문 위험이 증가하는 것으로 나타났다. 천명 등의 천식 증상, 복통 및 설사 등의 증상 발생 전 1주일간의 특정 바이오에어로졸 노출(흡입 또는 섭취)에 대해 박테리아 1,000 copies/m³ 증가 당최고 6.79배로 응급실 방문 위험이 증가했다. 각 11종의 병원성 의심 박테리아에 대한 분석에서는 박테리아별로 상이한 결과가 산출되었다. 전반적으로 일관되게 응급실 방문위험이 유의하게 증가한 박테리아는 Bacillus 종인 것으로 나타났으며, 그 외 박테리아에서는 연관성이 일관성 있게 나타나지는 않는 것으로 나타났다.

5) 황사 등 바이오에어로졸 박테리아 위해성 기초연구
역학 연구 결과를 바탕으로 용량-반응 함수 유도 및 몬테카를로 시뮬레이션을 시행하여 황사 등 바이오에어로졸에 대한 위해성을 확인하기 위한 기초연구를 수행하였다. 분석 결과, 응급실 방문 5일 전의 바이오에어로졸 농도 증가에 따른 천식의 응급실방문 위해도가 높은 것을 알 수 있으며, 대부분의 함수 계수가 불확실도가 다소 높은 수준임을 알 수 있었다. 이는 향후 이들 영향에 대한 민감도를 고려한 추가 분석이 필요한 것으로 판단된다. 또한, 시료 크기가 작기 때문에 불확실도가 높으므로, 향후 이에 대한 보완이 필요하다.

6) 병원성 의심 박테리아의 유해도 등급 리스트 작성
본 연구에서 수행한 (ⅰ) 16S rRNA 유전자 염기서열 기반 병원성 의심 박테리아 스크리닝, (ⅱ) 배양방법의 동정 및 독성 분석, (ⅲ) 기능성 유전자 분석,(ⅳ) 질병 발병 자료와의 통계적 상관성 분석을 통해 도출된 다면성의 결과를 바탕으로 최종 병원성 박테리아 유해도 등급을 1등급, 2등급, 3등급, 4등급으로 나누었다. 1등급은 ‘병원성 확실’ 판정, 2 등급은 ‘병원성 추정’ 판정, 3 등급은 ‘병원성의심’ 판정, 4등급은 ‘병원성 불확실’ 판정으로 구분했다. 이러한 근거에 의해 병원성 박테리아 등급 리스트를 체계적으로 정리하는 방법을 제시하였고 본 연구에서 황사 등 바이오에어로졸 내 박테리아 유해도 등급을 산정한 결과, B. cereus, B.lichenifomis, B. mycoides 계열의 박테리아 개체는 유해도 1등급의 병원성 박테리아일 가능성이 높은 것으로 나타났다.

바. 국제네트워크 구축 및 활성화
현재 바이오에어로졸 내 미생물을 검측하기 위한 표준화 방법의 부재, 바이오에 어로졸 미생물 검측 표준 방법의 부재, 바이오에어로졸 유해 미생물 DB 부족, 바이오에 어로졸 내 유해성 미생물 판별 방법 미확립 등으로 인한 한계점을 극복하기 위하여 국내외 전문가들과 국제 네트워크를 형성하여 운영하고 있다. 이를 통해 황사 등 바이오에어로졸로 인한 환경 피해 또는 환경에 미치는 부정적인 영향이 인접지역에 미치지 않도록 국가 간 공동 연구 및 관련 정보 공유가 필요함이 제시되었다. 특히 본 연구에서 개발, 최적화한 바이오에어로졸 미생물 분석 방법의 국제 표준화 추진을 위한 기반 구축이 본 연구 사업의 국제 네트워크 구축 및 활성화의 성과라고 평가한다.

( 출처 : 요약문 4p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• 목차 ... 12
• 표목차 ... 16
• 그림목차 ... 20
• 제 1 장 서 론 ... 24
• 가. 사업추진 배경 및 필요성 ... 24
• 나. 사업목표 및 범위 ... 28
• 다. 연구 추진체계 ... 29
• 제 2 장 바이오에어로졸 시료채취 방법 연구 ... 31
• 2.1 바이오에어로졸 시료채취 방법에 대한 문헌조사 ... 32
• 가. 시료채취 방법의 표준화 여부 ... 32
• 나. 대표적 시료채취 방법 비교분석 ... 33
• 다. NGS와 연계한 바이오에어로졸 채취 연구사례 ... 35
• 라. 시료채취 방법의 연구 필요성 ... 36
• 2.2 Filtration 방법 최적화 ... 37
• 가. Filter ... 38
• 나. 시료채취 시간 ... 44
• 다. 유입 대기 유량 ... 48
• 2.3 Impinger 방법 최적화 ... 54
• 가. 포집액 ... 56
• 나. 유입 대기 유량 ... 56
• 다. 포집액 부피와 시료 채취 시간 ... 57
• 2.4 미생물 분석 목적 별 시료채취 방법 선정을 위한 지침 ... 59
• 2.5 요약 및 토의 ... 60
• 제 3 장 Pyrosequencing을 이용한 미생물군집 분석 최적화 ... 62
• 3.1 Pyrosequencing 준비 단계 ... 63
• 가. 시료 전처리 및 DNA 추출 ... 63
• 나. 박테리아 PCR증폭 ... 71
• 다. 진균 PCR증폭 ... 79
• 라. 시료의 pooling ... 83
• 마. Pyrosequencing 의뢰 ... 84
• 3.2 Pyrosequencing 단계 ... 85
• 3.3 Pyrosequencing 염기서열 오류 최소화 단계 ... 87
• 가. 오류 염기서열 제거 ... 87
• 나. Pyrosequencing 정확성/신뢰성 평가 ... 98
• 3.4 미생물 군집 분석 전처리 단계 ... 103
• 가. 염기서열 정렬(Alignment) ... 103
• 나. 군집화 (Clustering) ... 104
• 다. Operational Taxonomy Unit (OTU) 계산과 대표 염기서열 추출 ... 105
• 3.5 미생물 군집 분석 단계 ... 106
• 가. 미생물 개체 다양성 (Diversity) 분석 ... 106
• 나. 미생물 군집 구성 및 구조 분석 ... 107
• 다. 미생물 개체 동정 (Identification) 분석 ... 108
• 3.6 요약 및 토의 ... 110
• 제 4 장 황사 바이오에어로졸 시계열 연구 ... 111
• 4.1 모니터링 방법 ... 112
• 4.2 총 박테리아 수 시계열 분석 ... 115
• 4.3 박테리아 군집 시계열 분석 (2011년-2013년) ... 116
• 4.4 황사 특이 박테리아 속 (genus) 수준 개체 파악과 목록화 ... 123
• 4.5 황사 특이 박테리아의 원거리 이동 여부 ... 124
• 가. 미세입자 역궤적 추적 ... 124
• 나. 추정 발원지의 토양 박테리아 분석 비교 ... 125
• 다. 박테리아 서식지 역추적 ... 127
• 라. 황사 박테리아 문헌조사 ... 128
• 4.6 진균 군집 시계열 분석 (2013년) ... 130
• 4.7 요약 및 토의 ... 138
• 제 5 장 시료채취 위치에 관한 기초연구 ... 140
• 5.1 지역적 위치에 따른 영향 ... 141
• 5.2 고도에 따른 영향 ... 147
• 5.3 배경(청정)지역에서의 박테리아 군집 분석 ... 149
• 5.4 요약 및 토의 ... 151
• 제 6 장 황사 등 바이오에어로졸 내 박테리아 유해도 분석 ... 153
• 6.1 16S rRNA 유전자 염기서열 기반의 병원성 의심 박테리아 스크리닝 ... 154
• 가. 병원성 의심 박테리아와 환경인자 사이의 상관관계 분석 ... 158
• 6.2 배양 기반의 병원성 의심 박테리아 동정 및 독성 분석 ... 159
• 가. 배양 및 DNA 추출 ... 159
• 나. 16S rRNA 유전자 full sequence를 통한 박테리아 동정 ... 161
• 다. B. cereus group 분리 균주에 대한 genotyping (MLST) ... 164
• 라. B. cereus group 분리 균주에 대한 virulence 평가 ... 167
• 6.3 기능성 유전자를 이용한 병원성 의심 박테리아 분석 ... 175
• 6.4. 질병발생 자료와의 통계적 상관성 분석 ... 180
• 가. 분석 방법 ... 181
• 나. 분석 결과 ... 182
• 다. 시료채취 시기에 따른 질병발생률 영향 분석 ... 196
• 6.5 황사 등 바이오에어로졸 박테리아 위해성 기초연구 ... 198
• 가. 박테리아 유해성 확인(hazard idenrification)절차에 관한 해외 사례연구 ... 198
• 나. 분석방법 ... 201
• 다. 분석결과 ... 201
• 6.6 병원성 의심 박테리아의 유해도 등급 리스트 작성 ... 204
• 6.7 요약 및 토의 ... 206
• 제 7 장 국제네트워크 구축 및 활성화 ... 209
• 7.1 황사 바이오에어로졸 및 미생물 분야 전문가 초청 ... 210
• 7.2 바이오에어로졸 국제 심포지움 개최 ... 213
• 가. 바이오에어로졸 국제 심포지움 발표 내용 (2013년) ... 215
• 7.3 지속적 교류 및 공동 연구 ... 219
• 7.4 바이오에어로졸 미생물 위해성 관련 방법 국제 표준화 및 국제공동연구 기반 형성 ... 220
• 7.5 요약 및 토의 ... 220
• 제 8 장 결론 및 제언 ... 221
• 제 9 장 참고문헌 ... 223
• 끝페이지 ... 232