초록 ▼

1. 목적
Mdm2 에 의해 저해된 p53 항암기능의 SUSP4 에 의한 회복 기전을 단백질-단백질 결합 구조 차원에서 규명하고자 함.

2. 연구방법
(1) Mdm2-SUSP4 결합 부위 및 정밀 3차 구조 규명
a) SUSP4, 2 종의 mdm2 및 p53 TAD 도메인 발현, 정제 (unlabeled & labeled)
b) 각 단백질 도메인 resonance assignment
c) Mdm2-SUSP4 결합 실험 (SPR)
d) Mdm2-SUSP4 결합 실험 (NMR)
e) 1

1. 목적
Mdm2 에 의해 저해된 p53 항암기능의 SUSP4 에 의한 회복 기전을 단백질-단백질 결합 구조 차원에서 규명하고자 함.

2. 연구방법
(1) Mdm2-SUSP4 결합 부위 및 정밀 3차 구조 규명
a) SUSP4, 2 종의 mdm2 및 p53 TAD 도메인 발현, 정제 (unlabeled & labeled)
b) 각 단백질 도메인 resonance assignment
c) Mdm2-SUSP4 결합 실험 (SPR)
d) Mdm2-SUSP4 결합 실험 (NMR)
e) 15N-labeled SUSP4 펩타이드 발현 정제
f) 15N-labeled SUSP4 펩타이드 mdm2-unbound 구조
g) SUSP4 펩타이드 + mdm2 TRNOE NMR 실험
h) SUSP4 펩타이드 mdm2 결합 구조 in silico modeling
(NMR restrained molecular dynamics)

(2) Mdm2 결합하는 SUSP4 조각의 항암 활성 검증
a) Mdm2-binding SUSP4 펩타이드 합성 정제
b) SUSP4 펩타이드 항암 활성 검증

(3) Mdm2 에 결합하는 부위를 포함한 SUSP4 catalytic domain 의 3차 구조 규명
a) SUSP4 catalytic domain 발현 정제 및 NMR 분광학적 3차 구조 규명

(4) SUSP4-p53 간의 결합 부위 규명
a) SUSP4 N-term, domain, p53 C-term domain 생산
b) SUSP4 N-term, domain + p53 결합 SPR 실험
c) SUSP4 N-term, domain + p53 결합 NMR 실험

3. 연구결과
1차년도에는 mdm2-SUSP4 결합 부위 확인을 하기 위해 labeled 또는 non-labeled mdm2(3-109)와 SUSP4(201-300) 단백질 정제 후, NMR resonance assignment 를 완료하였다. 이를 토대로 NMR titration 실험을 하였고 chemical shift perturbation (SAR-by-NMR) 을 측정하여 상호 결합하는 도메인의 구체적 결합 부위 (아미노산 서열 번호) 를 규명하였다. 또한, SPR 기법을 이용하여 이들의 결합정도를 측정하였다.
2차년도에는 mdm2 결합에 해당되는 SUSP4(263-291) 와 SUSP4(273-291) 부위를 펩타이드로 합성 및 정제하였다. 이들 펩타이드 또한 SPR 기법을 이용하여 결합정도를 알아보았다. SUSP4 펩타이드와 mdm2 간의 TRNOE 실험결과가 적절하지 않아서 computational modeling 방법을 이용하여 mdm2 에 결합된 SUSP4 펩타이드의 구조를 규명하는 방법을 시도하였다. 게다가, 이들 펩타이드에 의한 암세포 사멸실험을 통하여 항암 활성 검증을 하였다 (국내 특허 출원).

3차년도에는 SUSP4 catalytic domain, SUSP4 N-terminal domain, 그리고 p53 C-terminal domain을 정제하였고, SUSP4 N-terminal 과 p53 간의 결합실험을 하였다.

(출처 : 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 4p)

Abstract ▼

1. Objective
In order to clearly understand the recovery mechanism through activity of SUSP4 on association between p53 and mdm2 we apply SPR, NMR, in silico modeling, and anticancer activity methods.

2. Research mehtod
(1) Determination of binding region and detailed three dimensional

1. Objective
In order to clearly understand the recovery mechanism through activity of SUSP4 on association between p53 and mdm2 we apply SPR, NMR, in silico modeling, and anticancer activity methods.

2. Research mehtod
(1) Determination of binding region and detailed three dimensional structure on mdm2-SUSP4 interactions.
a) Expression and purification of SUSP4, two kinds of mdm2, and p53 TAD domain in E.coli (unlabeled & labeled).
b) Resonance assignment by three dimensional spectra of all proteins.
c) Binding experiment between mdm2 and SUSP4 using SPR technique.
d) Binding experiment between mdm2 and SUSP4 using NMR technique.
e) Expression and purification of 15N-labeled SUSP4 peptide.
f) Structural measurement of 15N-labeled SUSP4 peptide in mdm2-unbound state.
g) TRNOE experiment of SUSP4 peptide bound to 15N-labeled mdm2, the process of inducing chemical shift perturbation.
h) Complex structure of SUSP4 peptide and mdm2 by in silico modeling using NMR restrained molecular dynamics.

(2) Validation of anticancer activtiy in SUSP4 fragment bound to mdm2.
a) Synthesis and purification of mdm2-binding SUSP4 peptide.
b) Validation of anticancer activity in SUSP4 peptide.

(3) Determination of three dimensional structure in SUSP4 catalytic domain contained binding region of mdm2.
a) Expression, purification and determination of three dimensional structure based on NMR spectroscopy in SUSP4 catalytic domain.

(4) Validation of binding region between SUSP4 and p53.
a) Protein purification of SUSP4 N-terminal domain and p53 C-terminal domain in E.coli.
b) Affinity measurement through SPR analysis.
c) Confirmation of binding region using NMR spectroscopy.

3. Research results
In the first year we have purified labeled or non-labeled mdm2(3-109), mdm2(10-154) and SUSP4(201-300) in order to confirm binding region in mdm2-SUSP4 interactions. We assigned the chemical shifts of the backbone atoms using heteronuclear three dimensional NMR experiments. These results have been used in NMR titration experiments to map detailed binding region between mdm2 and SUSP4. In addition, the affinity for mdm2-SUSP4 interactions was measured by surface plasmon resonance (SPR).

In the second year we have purified both a SUSP4(263-291) and a SUSP4(273-291) peptides that were synthesized by a multiple peptide synthesizer. These peptides have been analyzed for its binding to mdm2 by SPR method. We also deteremined the structure of mdm2-SUSP4 peptide complex using computational modeling. And we confirmed the anticancer activity of SUSP4 peptide through MTT assay. [Domestic patent applied].

In third year we purified the SUSP4 catalytic domain, SUSP4 N-terminal domain, and p53 C-terminal domain. Using NMR and SPR methods, we are investigation the interaction between the SUSP4 N-terminal and the p53 C-terminal.

(출처 : Project Summery 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 4
• Project Summary ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 1) 연구배경 ... 8
• 2) 필요성 ... 8
• 3) 연구목적 ... 9
• 4) 연구범위 ... 10
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 11
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 12
• 1) SUSP4(201-300)의 화학적 이동 변동실험 ... 12
• 2) mdm2(3-109)의 화학적 이동 변동실험 ... 12
• 3) P4L29 이차구조 형성부위 펩타이드의 화학적 이동 변동실험 ... 12
• 4) P4S19 이차구조 형성부위 펩타이드의 화학적 이동 변동실험 ... 12
• 5) BIAcore 실험 ... 12
• 6) mdm2-P4L29 complex 의 in silico modeling ... 13
• 7) P4L29 및 P4S19 펩타이드에 의한 암세포 사멸실험 ... 13
• 8) SUSP4 N-terminal 과 p53 C-terminal 의 결합실험 ... 13
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 25
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 26
• (1) 연구성과 총괄 ... 26
• (2) 연구성과 상세내역 ... 27
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 34
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 35
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 35
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 35
• 7. 참고문헌 ... 36
• 8. 첨부서류 ... 37
• 끝페이지 ... 38