초록 ▼

1. 연구개발사업의 목적
○ 프로테오믹스 기술 중 다중반응탐지 고정밀 질량분석법 (Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry: MRM-MS)을 이용, 혈액내 간암 발생 진단용 특이 펩타이드군(Proteotypic peptide)을 선별하고, 이를 조합하여 최적의 간암 조기 진단 후보 표준 펩타이드 패널(군)을 발굴함.
○ 임상시료를 대상으로 이들 간암 마커 후보 펩타이드군(패널)이나 단백질마커의 정량적 변화를 측정, 간암의 조기 진단을 보다 저렴한 비용(ELISA 상품 대비)으로

1. 연구개발사업의 목적
○ 프로테오믹스 기술 중 다중반응탐지 고정밀 질량분석법 (Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry: MRM-MS)을 이용, 혈액내 간암 발생 진단용 특이 펩타이드군(Proteotypic peptide)을 선별하고, 이를 조합하여 최적의 간암 조기 진단 후보 표준 펩타이드 패널(군)을 발굴함.
○ 임상시료를 대상으로 이들 간암 마커 후보 펩타이드군(패널)이나 단백질마커의 정량적 변화를 측정, 간암의 조기 진단을 보다 저렴한 비용(ELISA 상품 대비)으로 추적 평가할 수 있는 새로운 적용기술을 개발함.
○ 이와 동시에 단백질 기반 간암조기 진단마커도 개발하며, ELISA 시스템을 구축하여 다수 임상시료에 대해 진단 유효성을 검증함.

2. 연구방법
○ 1차년도 연구: 간암샘플의 MRM 정량분석 표준시스템구축 및 후보 단백질 선정
① 간암 임상샘플의 MRM 정량분석을 위한 프로테옴분석 시스템구축과 적용시험
② 간암 혈액내 MRM 분석용 표지 단백질의 펩타이드 동정과 정량법 확립
③ 다양한 자체 연구방법으로 수집된 정보로부터 간암 특이 단백질 후보 다수 선정

○ 2차년도 연구: 임상검체를 이용한 간암 진단용 최적 펩타이드조합 후보군 패널 선정 및 신규마커인 hCE1의 ELISA 제작 및 기능연구
① 간암 특이 단백질 중 MRM 분석에 적합한 개별 펩타이드/transition 선정
② 간암 진단 MRM 최적 펩타이드 조합 후보군 선정(2-3set) 및 혈액내 검출 여부, 분석재현성 검증
③ 후보 마커 펩타이드에 대한 단백질 수준에서의 비교를 위한 항체 제작
④ 간암 특이 단백질(hCE1)의 특이 단일항체를 이용한 sandwich-antibody assay 검증
⑤ 간암 특이 단백질(hCE1) 발현 세포주를 이용한 기능 연구

○ 3차년도 연구: 간암진단용 펩타이드 패널 표준품 산출 (제품화 전단계 조성물)
① 간암 진단펩타이드 기반 펩타이드 후보 패널의 임상적 유효성 검증 (ROC값 상대 비교)
② 간암 특이적 펩타이드 기반 진단 시스템의 조성물 구성
③ hCE1의 간암마커로서의 전임상연구 (1차, 2차 검증)
④ 간암 마커후보 단백질의 간암 기전 기초 연구

3. 연구결과
○ 혈액내 간암 진단용 최적 MRM펩타이드 패널은 fibrinogen gamma, alpha-2-antiplasmin, alpha-2HS-glycoprotein, 이었으며, 세가지를 combination 했을 때, AUC 값이 0.967로 현재 간암 진단 단일 마커로 임상에서 사용되고 있는 AFP(AUC: 0.6~0.7)에 비해 매우 높은 결과를 얻었음.
○ 간암 진단 단백질 단일 마커인 hCE1에 대해 제작한 단일 항체는, 혈액내 hCE1을 정량적으로 분석할 수 있는 ELISA 시스템에 적용되었고, 다수의 질환에 대한 임상 혈장 실험 결과, AFP의 AUC value가 0.744인데에 반해, hCE1의 경우 AUC value가 0.918을 나타내었고,이 두 마커를 혼용했을 때는 0.938로서 매우 높은 값을 나타내었음. 즉, hCE1은 간경변과 간암 간의 구분력이 AFP 보다 월등히 높음을 증명하였음.
○현재까지의 결과를 토대로, c-Jun pathway, PKC/PKD pathway, lipid metabolism을 심도 있는 생물학적 연구법을 통해 확인하고, 관련된 주요 factor의 변화를 지속적으로 연구할 예정임

( 출처 : 요약문 4p )

Abstract ▼

1. Specific Aims
○ To identify and characterize the potential protein or peptide marker (proteotypic peptide) panels that are specific for detection of liver cancer ( Hepatocellular Carcinoma:HCC) in the plasma of the HCC patients using the high throughput proteomics technologies including Multip

1. Specific Aims
○ To identify and characterize the potential protein or peptide marker (proteotypic peptide) panels that are specific for detection of liver cancer ( Hepatocellular Carcinoma:HCC) in the plasma of the HCC patients using the high throughput proteomics technologies including Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry (MRM-MS) and
○ To develop a new evaluation system which can be applied to discover and optimize the potential MRM-based peptides by measuring quantitative changes of their abundance in the HCC clinical specimen, resulting more affordable HCC biomarkers compared to the conventional ELISA-based diagnositic system.
○ To develop a protein HCC biomarker which can be used as ELISA-based reference marker for evaluation of peptide-based MRM panels for detection of HCC in the plasma.

2. Experimental Strategy
○ Year 1 (2011):Establishment of MRM quantitation methods which can be used for selection of potential HCC candidate biomarkers.
➀ To set up the proteomic analytical system for MRM quantitation for the HCC specimen and evaluate its applicability to biomarker discovery.
➁ To establish an identification and quantitation method of peptides for MRM assay-based standard plasma proteins.
➂ To select HCC candidate proteins from various literatures and in-house screening procedures.

○ Year 2 (2012): Establishment of optimal peptide panels for biomarker candidates and preparation of ELISA kit of novel protein marker hCE1 with functional studis.
➀ To determine all possible transitions of peptides which are suotable for MRM analysis of HCC diagnosis.
➁ To select the optimized MRM peptide panels (2 to 3 sets) and evaluate their efficacy, reproducibility and suitability for the in vitro diagnosis of HCC using the patients' plasma.
➂ To prepare appropriate antibodies for the candidate biomarker peptides which can be used for evaluation of their efficiency in detection of HCC in the patients' plasma.
➃ To validate the sandwich-antibody assay kit of HCC -specific marker, hCE1, using the monoclinal antibody against hCE1.
➄ Functional studies of the HCC-specific protein biomarker hCE1 using the hCE1-overexpressed cell lines.

○ Year 3 (2013): Preparation of the list of standard peptides for further evaluation of the diagnostic efficiency of HCC
➀ Evaluation of clinical diagnostic efficiency of the HCC-specific MRM panels (ROC values )
➁ Identification of MRM-based peptide panel components for diagnosis of HCC.
➂ Preclinical test of hCE1 as a novel HCC biomarker (2 times validations)
➃ Functional studies of the hepatocellular carcinogenesis for the hCE1 marker .

3 . Results and Significance:
* Two sets of highly efficient novel HCC biomarker have been developed by our team.

○ From the studies of a peptide-based MRM panel for the HCC diagnosis: We were able to develop a novel HCC diagnostic peptide panel which is composed of three peptides, fibrinogen gamma, alpha-2-antiplasmin and alpha-2HS-glycoprotein . This MRM- based HCC diagnostic panel showed a remarkable diagnostic efficiency of HCC(AUC :0.967) in the patients' plasma which outperforms AFP ( AUC :0.6~0.7), currently available HCC protein biomarker.

○ From the studies of the protein-based biomaker hCE1 for the HCC diagnosis: We were able to develop a novel HCC diagnostic protein marker, hCE1, which can be used as an ELISA kit. The ELISA assay kit of hCE1 showed much higher AUC valued (0.918) than AFP (AUC=0.744) in diagnosis of HCC in the patients' plasma. When hCE1 and AFP are combined, there is slight elevation of AUC ( from 0.919 to 0.938).

Furthermore, hCE1 kit clearly distinguish HCC from other liver diseases ( liver cirrhosis,hepatitis), whereas AFP can not discriminate HCC from other liver diseases.


○ From the studies of functional and mechanictic insight into role of hCE1 in the hepatocellular carcinogenesis : It wa found that hCE1 appears to be involved in multiple signaling pathway involved in c- Jun pathway , PKC/PKD pathway , and lipid metabolism,which decerves further long - term cellular studies of hCE1 role in hepaticellular carcinogemesis.

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 가. 연구개발대상 기술의 경제적․산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 8
• 나. 연구개발대상 기술의 국내․외 현황 ... 18
• 다. 연구개발의 최종목표 ... 20
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 21
• 가. 연구의 전체 Workflow ... 21
• 나. 다음에 요약한 내용으로 간암샘플의 MRM 정량분석 표준시스템구축 및 후보 단백질 선정 ... 22
• 나. 임상검체를 이용한 간암 진단용 최적 펩타이드 조합 후보군 2-3개 패널선정 ... 25
• 다. 간암진단용 펩타이드 패널 표준품 산출 ... 28
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 32
• 가. MRM-MS를 이용한 혈액내 펩타이드 패널 분석 최적화 ... 32
• 나. 간암조직 및 간암혈액을 사용한 비교 연구를 통해 간암특이 단백질 분석 ... 38
• 다. 간암특이 단백질의 특이도 및 민감도 비교 분석 생물정보 툴 개발 ... 43
• 라. 과제 수행 과정에서 도출된 문제점 및 이에 대한 해결 방안 연구 ... 44
• 마. 효과적인 간암 진단 바이오마커 발굴을 위한 샘플 조정 ... 47
• 바. 혈장 시료 분석 결과들을 종합한 신규 MRM target 분석 ... 48
• 사. 간암조직내 간암특이 당단백질 분석 및 MRM 타겟 후보 당단백질 선정 ... 59
• 아. 간암 특이 단백질(hCE1)의 세포기능 연구 ... 70
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 80
• 5. 연구과제의 연구 성과 및 목표달성도 ... 86
• (1) 연구 성과 총괄 ... 86
• (2) 연구성과 상세내역 ... 87
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 95
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 96
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 96
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 96
• 7. 참고문헌 ... 99
• 8. 첨부서류 ... 101
• 끝페이지 ... 113