[보고서]산화환원 신호전달계 조절을 통한 노화제어 원천기술 개발

이서구

산화환원 신호전달계 조절을 통한 노화제어 원천기술 개발
Development of basic technology for aging control by regulation of redox signaling network 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	연세대학교 산학협력단 Yonsei University
연구책임자	이서구
참여연구자	권기선 , 정우진
보고서유형	3단계보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2015-11
과제시작연도	2013
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
등록번호	TRKO201700010065
과제고유번호	1711001008
사업명	바이오·의료기술개발
DB 구축일자	2017-11-13
키워드	퍼옥시레독신.설피레독신.세스트린.산화환원 조절.실험동물모델.활성산소.비만.미토콘드리아.일주기성랭클.파골세포.엔알에프2.퍼옥시레독신 저해제.항암제.녹스엑스.Peroxiredoxin.sulfiredoxin.sestrin.redox regulation.in vivo animal model.reactive oxygen species.obesity.mitochondria.circadian rhythm.RANKL.osteoclast.Nrf2.peroxiredoxin inhibitor.anticancer agents.NOXX.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201700010065

초록 ▼

제1세부과제 : 동물모델을 이용한 산화환원 신호전달 메커니즘 규명
• Sestrin 2 KO 마우스를 이용한 소포체 stress에 의한 표현형 규명 Sestrin 2의 역할 규명
• Aggrephagy, mitophagy 과정에 미치는 sestrin 2의 역할 규명
• Srx KO 마우스에서 고지방 식이에 의한 비만 모델의 표현형 분석과 대사성 증후군에서의 Srx의 기능 규명함
• 인간의 지방전구세포인 3T3L1 세포주의 지방세포로의 분화시 Srx 기능 규명함.
• 미토콘드리아 특이적 항산화효소의 작용 및 조절 기전 규명
• mouse 일주기 조절에 미치는 Srx, Prx의 기능 규명함
• 적혈구내 PrxII의 과산화 일주기성 관찰과 원인규명을 통한 레독스의 일주기성 규명함
• 가역적으로 변형된 단백질을 선택적으로 인식하는 세포내 항체(intrabody)를 이용한 신호전달 분석함
• PrxIII에 의한 대식세포의 사이토카인 분비 조절기작 연구

제2세부과제 : 산화환원 반응의 작용표적 및 조절인자의 기전 규명
• 파골세포분화를 억제하는 RANKL 항체를 발굴함
• Nrf2의 파골세포분화 조절기능을 검증함
• RNAKL 항체 및 Nrf2에 의한 RANKL-induced 신호전달 조절 기전을 규명함
• RANKL항체에 의한 파골세포 분화 및 기능 억제효능을 규명함
• Nrf2 활성조절을 통한 파골세포 분화조절 가능성을 제시함
• 항산화 시스템인 Prx의 활성저해제의 구조적 유사 화합물 설계 후 및 확보함
• Prx 저해제의 활성 억제능과 암세포 사멸능 측정을 통해 efficacy가 가장 큰 저해제 선별함
• 선별된 Prx 저해제의 Prx 활성 억제 기전 규명함
• Prx 활성 저해에 의한 암세포 내 활성산소 축적 증가 및 증가된 활성산소에 특이적인 암세포 사멸 작용 검증함
• Prx 활성 제어에 의한 암세포 사멸 관련 신호 네트워크의 변화 규명함
• Prx 활성 저해에 의한 암세포 특이적 성장 억제 및 세포사멸 규명함
• 활성산소 증가가 매개하는 암세포 특이적 사멸작용 검증함
• Srx 억제를 통한 암세포의 세포사멸 신호전달에서의 활성산소 역할을 규명함
• Srx 억제를 통해 Srx inhibitor의 항암제 가능성을 규명함
• 암치료 신규타겟 유전자 NOXX의 세포내 역할 검증 완료
• 항암제 Cisplatin에 의한 NOXX 기전 및 개체수준에서 NOXX항체를 이용한 항암효과 규명함

( 출처 : 요약서 3p )

Abstract ▼

IV. The results of research
Subsection (1)
1) Identification of the role of Sestin 2 in mitochondia, ER stress and authophagy
• Protective role of Sestrin 2 in ER stress by the inhibition of mTOR signaling
• Sestrin 2 facilitates the degradation of Keap 1 by aggrephagy
• Sestrin 2 facilitates the translocation of Parkin in CCCP-induced mitophagy

2) Identification of the role of Prx, Srx and the regulation of mitochondrial ROS in adiopocyte differentiation
• ROS promotes the differentiation of 3T3-L1 cells and brown preadipocytes and lipid degradation in mature adipocytes.
• The differentiation of adipocytes is regulated by the concerted action of Prx and Srx

3) Identification of the role of Prx and Srx in mouse circadian rhythms
• The hyperoxidized Prx is oscillated in mouse red blood cells.
• The oscillation of hyperoxidized PrxII in mouse RBCs is driven both by hyperoxidation mediated by ROS production during hemoglobin-dependent oxygen transport and by detradation of the hyperoxidized enzyme by the proteasome.
• Membrane association of hyperoxidized PrxII is a tightly controlled process and might play a role in the tuning of red bllod cell function.

4) Identification of the role of Prx and Srx in high fat-induced mouse obesity models
• PrxI and Srx are increased in high fat-induced mouse obesity model.
• ER membrane-bound PrxI is hyperoxidized in high fat-induced Srx KO mouse obesity model.
• Nox4 is responsible for the production of ROS in high fat-induced obesity model.

5) Identification of the signaling pathway with site-specific intrabodies
• Development and characterization of pY705-STAT3 intrabody
• pY705-STAT3 intrabody is able to block specifically the downstream effects of pYSTAT3 without influencing those of pSSTAT3.
• Development and characterization of Ac-Lys PrxIII intrabody
• Development and characterization of hyperoxidized Prx intrabody
• Development and characterization of pY759-PLC-γ2 intrabody

6) Regulation of cytokine production in macrophages via the mitochondrial release of H₂O₂ that is controlled by the concerted action of Peroxiredoxin III and Sulfiredoxin
• Production of mitochondrial ROS by inhibition of UCP2
• Regulation of mitochondrial ROS in macrophages via PrxIII and Sulfiredoxin
• Regulation of cytokine secretion in macrophages by hydrogen peroxide which is controlled by PrxIII and Srx

Subsection (2)
1) The regulatory functions of anti-RANKL antibody and Nrf2 in osteoclast differentiation
• Selection of the best anti-RANKL antibody that inhibits osteoclast differentiation
• Evaluation of the function of Nrf2 that regulates osteoclast differentiation
• Elucidation of the mechanism by which anti-RANKL antibody and Nrf2 control RANKL-induced signal transduction
• Elucidation of inhibitory function of anti-RANKL antibody on the differentiation and bone resorption of osteoclasts
• The proposed inhibitory role in osteoclast differentiation of compounds that regulate Nrf2 activation.

2) Effective killing of cancer cells through ROS-mediated mechanisms by peroxiredoxin inhibitors
The intrinsic increase of reactive oxygen species (ROS) production in cancer cells after malignant transformation frequently induces redox adaptation, leading to enhanced antioxidant capacity. Peroxiredoxin I (PrxI), an enzyme responsible for eliminating H₂O₂, has been found to be elevated in many types of cancer cells.
Since overexpression of PrxI promoted cancer cells' survival and resistance to chemotherapy and radiotherapy, PrxI has been proposed as a therapeutic target for anticancer drugs. Here we aimed to investigate the anticancer efficacy of a small molecule inhibitor of PrxI. By a screening approach, we identified PI-76 as a potent inhibitor of PrxI. PI-76 increased cellular ROS, leading to the activation of both mitochondria-mediated signaling pathways, resulting in apoptosis of A549 human lung adenocarcinoma. Pretreatment of cells with N-acetyl cysteine abrogated PI-76-induced cytotoxicity. PI-76 rendered tumorigenic ovarian cells more susceptible to ROS-mediated death compared with nontumorigenic cells.

3) Identified the role of ROS in cancer cell apoptosis signals using Srx knockdown PDX mouse model
• Production of Srx shRNA virus
• Production of Srx knockdown cancer cell line using patient-derived cancer cell
• Deficiency of Srx increase the apoptosis of cancer cell
• Identification of inhibiting cancer cell growth by Srx knockdown

4) Study on the redox-mediated cell signaling network
Moderate expression of NOXX, regulated by STAT5A, induces cancer cell proliferation, whereas an increase in NOXX over a certain threshold promotes cancer cell death. We identify that cisplatin treatment increases (i) NOXX levels through CREB activation and (ii) NOXX activity through Ca2+ release and c-Abl augmentation, eventually triggering cancer cell death. Our findings provide a rationale for decisions regarding combinatorial therapy with cisplatin; cisplatin can be used synergistically with Ca2+- enhancing antineoplastic agents, whereas cisplatin should not be administered with Ca2+ antagonizers, including hypertension medications, and c-Abl inhibitors such as imatinib. We also demonstrate that NOXX inhibition causes cancer cell death and thus is a promising therapeutic strategy.

( 출처 : SUMMARY 14p )

목차 Contents

표지 ... 1제 출 문 ... 2보고서 요약서 ... 3요 약 문 ... 5SUMMARY ... 12CONTENTS ... 19목차 ... 20제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 21 제 1 절 연구개발의 목적 ... 21 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 23 제 3 절 연구개발의 범위 ... 28제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 30제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 36 제 1 절 1차년도 연구개발수행 내용 및 결과 ... 36 제 2 절 2차년도 연구개발수행 내용 및 결과 ... 63 제 3 절 3차년도 연구개발수행 내용 및 결과 ... 114제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 141 제 1 절 목표달성도 ... 141 제 2 절 관련분야에의 기여도 ... 149제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 181제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 183제 7 장 연구시설·장비 현황 ... 185제 8 장 참고문헌 ... 186끝페이지 ... 193

표/그림 (137)

표 Tunicamycin induces Sestrin 2 expression in Hepa1c1c7 cells
표 Tunicamycin induces Sestrin 2 expression in mouse liver
표 Brown preadipocyte의 지방세포로의 분화
표 지방 세포 분화 표식 유전자 발현
표 Brwon preadipocyte와 3T3-L1 지방 분화 시, Srx의 변화
표 Prx III와 Prx V의 유전자 결손 MEF
표 Prx III MEF에서 항산화효소의 발현
표 Prx V MEF에서 항산화효소의 발현
표 Prx III Prx V의 결손이 GOx에 의한 세포사에 미치는 영향
표 Cisplatin의 세포자살 유발에 대한 Prx V의 영향
표 일주기성 변화에 따른 Prx III 과산화 및 Srx 발현양상
표 Circadian oscillation of PrxII hyperoxidation in wildtype mice RBCs
표 Circadian oscillation of PrxII hyperoxidation in Srx-/- mice RBCs
표 Comparison of circadian oscillation in PrxII hyperoxidation of Srx+/+ with Srx-/- mice RBCs
표 Effect of hemoglobin auto-oxidation on PrxII hyperoxidation in mice RBCs
표 Effect of proteasome inhibition on circadian oscillation of PrxII hyperoxidation in mice RBCs
표 Specific degradation of hyperoxidized PrxII by purified 20S Proteasome
표 Ubiquitin-independent proteolysis of hyperoxidized PrxII
표 High fat diet에 의한 마우스의 지방조직에서의 항산화 효소의 발현 양상
표 High fat diet에 의한 마우스의 체젓 측정
표 High fat diet에 의한 마우스의 지방세포 크기 증가
표 인체 시료 유전자 발현 데이터베이스 현황
표 인체 암 조직 유전자 발현 데이터베이스 현황
표 임상 암환자의 조직에서의 NOXX의 mRNA 발현 양상 A. 유방암 B. 폐암
표 임상 폐암환자 조직에서의 NOXX의 발현 양상
표 임상 유방암환자 조직에서의 NOXX의 발현 양상
표 Tunicamycin induces Sestrin 2 expression in Hepa1c1c7 cells
표 ER stress-specific induction of Sestrin 2 in Hepa1c1c7, HeLa, and HEK293 cells
표 ER stress-induced induction of Sestrin 2 is not dependent on ROS in Hepa1c1c7 cells
표 ER stress-induced induction of Sestrin 2 is not dependent on p53 in Hepa1c1c7 cells
표 ER stress-induced induction of Sestrin 2 is dependent on ATF4
표 Tunicamycin induces Sestrin 2 expression in mouse liver
표 Tunicamycin regulates mTOR signaling in mouse liver
표 Ablation of Sestrin 2 augments mTOR signaling andER stress in mouse liver
표 Ablation of Sestrin 2 augments liver damage and proposed model
표 Arsenite (As)-induced Keap1 degradation is mainly dependent on Atg7
표 Arsenite (As)-induced Keap1 degradation is mainly dependent on p62
표 Validation of Ser351 phospho-p62 antibody
표 Ablation of Sesn2 attenuates As-induced Keap1 degradation, p62 phosphorylation and Nrf2 activation
표 AMPK induces As-induced p62 phosphorylation and Keap1 degradation
표 Sestrin 2 knockdown ameliorates As-induced autophagy
표 Ablation of Sestrin 2 ameliorates autophagic Keap1 degradation and proposed model
표 CCCP induces translocation of Parkin
표 Knockdown of Sestrin 2 attenuates CCCP-induced translocation of Parkin
표 Sestrin 2 promotes CCCP-induced translocation of Parkin
표 Sestrin 2 specifically interacts with Parkin
표 p62 specifically interacts with Parkin
표 Sestrin 2 interacts with Parkin and model for Sestrin 2-mediated translocation of Parkin
표 Brown preadipocyte 분화시 Srx, Prx 발현 변화
표 지방 분해시 Srx 및 Browning marker gene, FGF21 의 발현 증가
표 AP-1 의존적 Srx 발현 증가
표 지방분해시 Prx III-SO2 및 p-p38 MAPK 증가 지방 분해시 Srx knockdown 시킨 세포에서 PrxIII의 불활성화 형태인 PrxIII-SO2 양이 증가
표 미토콘드리아 H2O2와 p38 MAPK의 연관성
표 정상 마우스의 Prx의 과산화 일주기성
표 정상 마우스의 Prx의 과산화 일주기성
표 PrxVI (A, B)와 GAPDH (C ,D) 과산화 일주기성
표 PrxI (A, B) 과 PrxII (C)가 결손된 마우스에서의 과산화 일주기성
표 정상 마우스(Srx+/+)와 Srx결손 마우스(Srx-/-)에서의 PrxII의 과산화 일주기성
표 일산화탄소 (CO)처리시 PrxII의 과산화 일주기성(A, B)과 헤모글로빈 흡광도 변화(C)
표 Proteasome 저해제(A, B)과 Ca2+ 의존성 단백질분해효소의 저해제 (C, D) 처리시 PrxII의 일주기성 변화
표 20S Proteasome complex의 정제(A) 및 과산화된 PrxII와 환원된 PrxII의 혼합조건 (B, C, D)과 환원된 PrxII의 조건(E, F) 에서의 산화된 PrxII (PrxII-SO2H)와 환원된 PrxII (PrxII)의 분해 정도
표 여러 세포주에서 PrxII와 Srx의 양(A)과 과산화된 PrxII의 정량적 분석(B, C)
표 적혈구의 나이에 따른 PrxII의 감소. 적혈구의 나이에 따른 분획(A)과 각 분획별 PrxII, GAPDH, PrxVI의 과산화 정도 (B, C)
표 적혈구막 (RBC ghost)에서의 PrxII 과산화 일주기성(A)과 전체와의 비교(B, C), 적혈구막에서 GO에 의한 산화적 스트레스에 의해 유발되는 과산화된 PrxII의 위치 변화
표 산소 농도 20%(A)와 10%(B)에서의 PrxII의 과산화 일주기성
표 Srx 발현정도를 낮춘 Per2::luc knockin MEF
표 정상 세포와 Srx 발현 정도를 낮춘 세포에서 관찰한 Per2 발현 양상의 변화
표 Body weight and organ weight/ body weight ratio in Srx-deficient mice
표 Effect of HFD on hyperoxidation of 2-Cys Prxs in adipose tissue of Srx-deficient mice
표 Effect of HFD on oxidative stress in adipose tissue of Srx-deficient mice
표 Phage display를 이용한 intrabody 제작 과정
표 HepG2 세포에서 인산화된 STAT3에 특이적인 intrabody에 의한 STAT3의 핵으로의 이동 저해와 타겟 유전자 발현 억제
표 마우스 간조직에서 인산화된 STAT3에 특이적인 intrabody에 의한 STAT3의 핵으로의 이동 저해와 타겟 유전자 발현 억제
표 HepG2 세포에서 Tyr잔기에 인산화된 STAT3 특이적인 intrabody에 의한 STAT3 Ser 잔기의 인산화와 타겟 유전자 발현에 미치는 영향
표 3F1 항체에 의한 RANKL-induced NFkB 및 MAPK의 활성화의 억제
표 3F1 항체에 의한 RANKL-induced c-Fos 및 NFATc1 발현의 억제
표 3F1 항체에 의한 RANKL-induced actin ring 형성의 억제
표 Nrf2 결손에 의한 RANKL-induced NF-kB 활성화의 조절
표 Nrf2 결손에 의한 RANKL-induced MAPK 활성화의 촉진
표 Nrf2 결손에 의한 RANKL-induced c-Fos, NFATc1 유전자 발현의 촉진
표 Nrf2 결손에 의한 RANKL-induced actin ring 및 resorption pit 형성 촉진
표 선별된 Prx I 저해제인 PI-76이 농도 의존적으로 사람의 폐암세포인 A549의 성장을 억제시키는 효과
표 PI-76이 시간 의존적으로 사람의 폐암세포인 A549의 cytotoxicity를 증가시키는 효과
표 PI-76이 사람의 폐암세포인 A549의 활성산소를 농도 의존적으로 증가시키는 효과
표 PI-76이 사람의 폐암세포인 A549의 활성산소를 시간 의존적으로 증가시키는 효과
표 PI-76이 사람의 폐암세포인 A549의 사멸을 농도 의존적으로 증가시키는 효과
표 PI-76이 사람의 폐암세포인 A549의 사멸을 시간 의존적으로 증가시키는 효과
표 PI-76에 의한 활성산소축적이 NAC에 의해 억제되는 효과
표 PI-76에 의한 세포사멸작용이 NAC에 의해 억제되는 효과
표 PI-76에 의한 미토콘드리아 막 전압의 변화
표 PI-76에 의한 caspase3의 활성
표 PI-76에 의한 미토콘드리아 막의 손상이 항산화제 NAC에 의해 억제되는 효과
표 사람의 Srx shRNA virus 제작 및 A549 세포주에서 Srx knockdown 확인
표 Srx가 knockdown된 폐암 환자의 일차 배양 세포주 확립
표 유방암 세포주인 SKBR3 세포에서 NOXX 발현 억제에 따른 세포 성장 A. NOXX siRNA가 잘 작용함을 보이는 immunoblotting B. 세포성장
표 정상 폐 세포주인 WI-38 세포에서 NOXX 발현 에 따른 세포 성장
표 NOXX 발현 억제에 따른 세포의 성장 A. melanoma 세포주 SK-MEL-5에서의 NOXX shRNA에 의한 세포성장 변화 B. 폐암 세포주 HOP-92에서의 NOXX shRNA에 의한 세포성장 변화 C. 유방암 세포주 SK-BR-3에서의 NOXX shRNA에 의한 세포성장 변화
표 폐암 세포주인 HOP-92 세포에서 NOXX 발현 억제에 따른 세포 이동 변화 A. 세포 이동을 보이는 현미경 사진 B. A를 수치화 한 그래프
표 폐암 세포주인 HOP-92 세포와 유방암 세포주인 SKBR3에서 cisplatin 처리시 NOXX 발현 증가 A. 폐암 세포주인 HOP-92 세포에서 cisplatin 처리시 NOXX의 RNA 발현 증가 B. 유방암 세포주인 SKBR3 세포에서 cisplatin 처리시 NOXX의 RNA 발현 증가 C. 유방암 세포주인 SKBR3 세포에서 cisplatin 처리시 NOXX의 단백질 발현 증가
표 폐암 세포주인 HOP-92 세포와 유방암 세포주인 SKBR3에서 cisplatin 처리시 활성산소 증가
표 폐암 세포주인 HOP-92 세포에서 DPI가 cisplatin 처리 시 생성 되는 활성산소 감소시킴
표 폐암 세포주인 HOP-92와 유방암 세포주인 SKBR3에서 NOXX siRNA가 cisplatin 처리 시 생성되는 활성산소 감소시킴
표 유방암 세포주인 SKBR3에서 STAT5의 과발현에 의한 NOXX 발현 변화
표 유방암 세포주인 SKBR3에서 STAT5의 shRNA에 의한 NOXX 발현 변화
표 Luciferase assay STAT5에 의한 NOXX reporter 활성의 변화
표 Chromatin immunoprecipitation
표 임상 유방암환자 조직에서의 p-STAT5와 NOXX의 발현 양상
표 Subcellular distribution of antioxidants in adipose tissue of mice fed HFD
표 Body weight and organ weight/ body weight ratio in Nox4-deficient mice
표 Role of Nox4 in Srx induction in adipose tissue of mice fed HFD
표 Effect of HFD on oxidative stress in adipose tissue
표 Model for HFD-induced ROS generation, Prx I hyperoxidation, and Srx expression in the mouse adipose tissue
표 Sirt3 WT과 KO 간조직에서 아세틸화된 PrxIII에 대한 scFv의 특이적 결합
표 마우스 갈색지방조직을 이용한 면역 침전 반응
표 NIH3T3 세포에서의 Intrabody 발현
표 발현된 Intrabody에 의해 탈인산화가 저해된 PrxIII
표 HEK293세포에서의 Intrabody 발현
표 제작된 항체의 PLC-γ2(pY759) 펩티드와의 결합 특이성
표 대식세포에서 사이토카인 분비 시 미토콘드리아 과산화수소의 생성
표 UCP2의 억제에 의한 대식세포의 미토콘드리아 과산화수소의 생성
표 PrxIII와 Srx에 의한 대식세포 미토콘드리아 과산화수소의 조절
표 PrxIII와 Srx에 의한 과산화수소의 조절과 p38의 활성도 조절
표 PrxIII KO mouse에서 대식세포의 사이토카인 분비량의 증가
표 Inhibition of mouse or human RANKL-induced osteoclast differentiation by 3F1. BMMs were cultured with 20 ng/ml of M-CSF and 100 ng/ml of mouse (A) or human (B) RANKL for 5 days in the presence of FLG5 (control scFv) or 3F1 at the indicated molar ratio to RANKL. The cells were fixed, subjected to TRAP staining, and observed under a light microscope (left panels). Scale bar, 200 μm. The TRAP-positive multinucleated cells containing more than 3 nuclei (TRAP+MNCs) werecounted (rightpanels). All values represent means±SD. n=3. *P < 0.05; **P < 0.005; ***P<0.0005
표 Inhibition of mRANKL-induced bone resorption by 3F1. BMMs on dentine discs were incubated with mRANKL (100 ng/ml) and M-CSF (20 ng/ml) for 9 days in the presence of 3F1 at a 30:1 molar ratio to RANKL, after which the cells were removed from the dentine discs and resorption pits were visualized by staining with hematoxylin. Scale bar, 200 μm (left). Data represent means ± SD. n=3. *P < 0.0005 (right)
표 Inhibition of mRANKL-induced osteoclast differentiation by 3F1 immunoglobulin. BMMs were cultured with mRANKL (100 ng/ml) and M-CSF (20 ng/ml) for 4 days in the presence of FLG5 (control Ig) or 3F1 at the indicated molar ratio to mRANKL. The cells were fixed, subjected to TRAP staining, and observed under a light microscope (left panels). Scale bar, 200 μm. The TRAP-positive multinucleated cells containing more than 3 nuclei (TRAP+MNCs)werecounted(right panels). All values represent means ± SD. n=3. *P < 0.01; **P < 0.005
표 Increased oxidative stress and decreased levels of antioxidant enzymes in Nrf2-deficient BMMs. (A) BMMs were treated with RANKL (100 ng/ml) in the presence of M-CSF (20 ng/ml) for the indicated times, washed with α-MEM lacking phenol red and then incubated with 5 mM CM-H2DCFDAin the dark for 5 min. DCF fluorescence was visualized using a confocal laser-scanning microscope. Scale bar, 50 mm (left panels). The relative fluorescence intensity per cell was measured by averaging the values for five groups of cells in each image (rightpanel). The values represent means ± SD. n=3. *P< 0.01; **P< 0.005. (B) The cells were prepared as Fig. 3A and then analyzed by a flow cytometer (left panel). The values represent means ± SD. n=3. **P< 0.005 (right panel). (C) BMM cells were treated with or without RANKL (100 ng/ml) in the presence of M-CSF (20 ng/ml) for 10 min. The amounts of total GSH and GSSG were measured, and total GSH level (nmole/mg protein) (left panel) and the GSH to GSSG ratio (right panel) were calculated as described in Materials and Methods. The values represent means ± SD. n=4. **P<0.005. (D) The bone marrow (BM) cells were isolated from the bone marrow cavity of wild-type and Nrf2-null mice and then were cultured in the presence of M-CSF (20 ng/ml) for 3 days to obtain BMM cells. The lysates of the BMM cells prepared from each two mice were subjected to immunoblot analysis using antibodies specific for the indicated proteins. The arrowhead indicates the band specific for TrxR2 (left panels). The chemiluminescence signals for each protein were quantified and normalized based on the signals for b-actin. The relative level of each protein is presented as the means ± SD (right panels). n=2. *P<0.05; **P<0.01
표 (A) BMM cells were exposed to RANKL (100 ng/ml) in the presence of M-CSF (20 ng/ml) for 6 h. The mRNA levels of Nrf2 and its target genes were analyzed as in E. The values represent means ± SD. n=3. (B) BMM cells were preincubated with 10 mM MG132 for 1 h and treated with RANKL (100 ng/ml) for 4 h in the presence of M-CSF (20 ng/ml). The cell lysates were subjected to immunoblot analysis using antibody specific for Nrf2
표 Inhibition of RANKL-induced OC differentiation and ROS generation by NAC or DPI. (A and C) BMMs were incubated with RANKL (100 ng/ml) and M-CSF and D) BMMs were preincubated with increasing doses of NAC (B) or DPI (D) as indicated for 60 min. The cells were treated with 100 ng/ml of RANKL for 10 min and the intracellular ROS were assayed. Scale bar, 50 mm (left panels). The values are means ± SD. n=3. **P< 0.001; ***P< 0.0005 (right panel) (20 ng/ml) in the presence of NAC (A) or DPI (C) of the indicated concentrations for 3 or 4 days. The cells were stained for TRAP (left panels) and the TRAP-positive MNCs were counted (right panel) as described in Fig. 1. Scale bar, 200 mm. The values are means ± SD. n=3. *P< 0.005; **P< 0.001; ***P< 0.0005. (B
표 Inhibition of RANKL-induced OC differentiation by Nrf2 activation. BMMs were incubated with RANKL (100 ng/ml) and M-CSF (20 ng/ml) in the presence of 0.1 mM sulforaphane (SFN) or 5 mM curcumin (Cur) for 3 days (A) or 6h (B). (A) The cells were stained for TRAP (left panels) and the TRAP-positive MNCs were counted (right panel) as described in Fig. 1. Scale bar, 200 mm. The values are means ± SD. n=3. *P< 0.05; **P< 0.005; ***P< 0.0001. (B) The mRNA levels of Nrf2 and its target genes were analyzed as in Fig. 3E. The values represent means ± SD. n=3. *P< 0.05; **P< 0.005
표 BMMs were preincubated with 10 μM SP600125 for 24 h, and then treated with 100 ng/ml of RANKL for 3 days. The cells were stained for TRAP (left panels) and the TRAP-positive MNCs were counted (right panel) as described in Fig. 1. Scale bar, 200 mm. The values are means ± SD. n=3. **P< 0.005
표 Effects of PI-76 on the preferential induction of cell death in H-RasV12-transformed cells. (A) Concentration-dependent effect of PI-76 on cell death. T80 and T80Ras cells were cultured with the indicated concentrations of PI-76 for 72 hr. (B) Time-dependent effect of PI-76 on cell death. T80 and T80Ras cells were treated with 30 μM PI-76 for the indicated times. Cell death was analyzed by flow cytometry using FITC-conjugated annexin V and propidium iodide. Cell death was calculated as the percentage of annexin V- or propidium iodide-positive cells. (C) Inhibition of cell proliferation by PI-76 in T80 and T80Ras cells. Cell growth inhibition was measured by long-term WST-1 assay. Data were expressed as means ± SD of three independent experiments. *: p < 0.05; **: p < 0.01 compared to that of T80 cells
표 Effects of PI-76 on the preferential induction of ROS accumulation mitochondrial damage in H-RasV12-transformed cells. T80 and T80Ras cells were incubated with 30 μM PI-76 for the indicated times. (A) Time-dependent ROS accumulation induced by 30 μM PI-76 in T80 and T80Ras cells. Intracellular ROS levels were measured by flow cytometry using CM-H2DCFDA. (B) Effect of PI-76 on oxidation of cardiolipin in mitochondrial membrane; (C) Effect of PI-76 on mitochondrial membrane potential ΔΨm; Cells loaded with NAO (B) or TMRE (C) were analyzed by flow cytometry. Data were expressed as means ± SD of the percentage of cells with low ΔΨm (a) or low NAO fluorescence (b) from three independent experiments. *: p < 0.05; **: p < 0.01 compared to T80 cells
표 Selective killing of H-RasV12-transformed cells by PI-76 through ROS-mediated damage. T80Ras cells were incubated with DMSO (-) or 30 μM PI-76 (+) in the absence (-) or presence (+) of 1 mM NAC for 48 h. (A) Effect of antioxidant NAC on PI-76-induced ROS accumulation in T80Ras cells. Intracellular ROS levels were measured by flow cytometry using CM-H2DCFDA; (B and C) The left panels show the effects of NAC on PI-76-induced cardiolipin oxidation (B) and ΔΨm loss (C); (D) Effect of antioxidant NAC on PI-76-induced cell death in T80Ras cells. Cell death was analyzed by flow cytometry using FITC-conjugated annexin V and propidium iodide. Data were expressed as means ± SD of three independent experiments. **: p < 0.01
표 Srx deficiency increases apoptosis of cancer cell. (A) Structure of PEITC. (B) YHN-scramble shRNA and YHN-Srx shRNA cell were incubated in the presence of PEITC (10uM). The sample was subjected to SDS-PAGE for immunoblot analysis with antibodies for indicated proteins
표 Srx deficiency increases the activity of p38 by hydrogen peroxide. (A) YHN-scramble shRNA and YHN-Srx shRNA cell were incubated in the presence of PEITC (10uM). The lysates were subjected to immunoblot analysis of Prx-SO2, Prx III, p-p38, and p38. The band of p-p38 indicated activity of p38 protein
표 Inhibition of tumor growth by Srx inhibition. Nude mice (n=5) received subcutaneously injection of 5X106 YHN cells bearing scramble-shRNA or Srx shRNA. The mice were monitored for tumor growth throughout the experiment. Tumor volume was calculated using the following equation: tumor volume (mm3)=Length(L) *Width(W)*(L+W)/2*0.526

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