보고서 정보
주관연구기관 |
가톨릭대학교 Catholic University of Korea |
연구책임자 |
김은민
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2016-12 |
과제시작연도 |
2015 |
주관부처 |
미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning |
등록번호 |
TRKO201700011778 |
과제고유번호 |
1345240124 |
사업명 |
이공학개인기초연구지원 |
DB 구축일자 |
2017-11-04
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201700011778 |
초록
▼
마우스의 BMDC를 분리하여, GM-CSF와 IL4로 monocyte로 분화시킨 후, TNF-alpha만으로 미성숙 면역관용 수지상 세포를 4 hr 처리하여 면역관용 수지상 세포로 활성화 시키는 방법으로, 현재 심근염 치료에 효능이 있다는 보고와, 류마티스 관절염의 치료에 효능이 있다는 것을 보고하였음. 따라서, TNF-alpha로 자극한 면역관용 수지상 세포에서의 발현 차이가 있는 microRNA를 찾음으로 인하여, 기존에 사용하였던, pharmacological 한 약재를 대체할 수 있는 치료제를 발굴할 것이라는 기대로 진행함.
마우스의 BMDC를 분리하여, GM-CSF와 IL4로 monocyte로 분화시킨 후, TNF-alpha만으로 미성숙 면역관용 수지상 세포를 4 hr 처리하여 면역관용 수지상 세포로 활성화 시키는 방법으로, 현재 심근염 치료에 효능이 있다는 보고와, 류마티스 관절염의 치료에 효능이 있다는 것을 보고하였음. 따라서, TNF-alpha로 자극한 면역관용 수지상 세포에서의 발현 차이가 있는 microRNA를 찾음으로 인하여, 기존에 사용하였던, pharmacological 한 약재를 대체할 수 있는 치료제를 발굴할 것이라는 기대로 진행함.
선행연구로 time point maturation 진행을 위하여, TNF-alpha 0, 2, 4, 12, 24 hr 후에 수지상 세포를 harvest 하여 MICRORNA array 를 실시하였고, Array 결과를 바탕으로 면역관용 수지상 세포의 특성을 지니고 있는, 4 hr 에 발현 증가하는 microRNA를 선별과 동시에, 면역관용 수지상 세포에서 발현 증가한다고 보고되어있는 MIR-155와 miR-23b를 positive control을 포함하여, 16개의 microRNA primer를 주문. 이 후, array의뢰에 사용된 total RNA를 sscDNA 합성 후, real time PCR이라는 방법으로 발현 변화를 validation.
그 결과, positive control인 MIR-23b와 155과, 나머지 14종류의 microRNAs 중 준비한 모든 샘플에 의미있게 증가한 3개의 microRNAs (mmu-miR-672, 229b, 383) 를 선별. Validation에 의해 선별된 microRNAs의 과발현을 유도하기 위하여 3가지의 microRNA의 mimic microRNAs (제놀루션)를 주문 의뢰하여, mouse에서 BMDC 분리후, GM-CSF와 IL-4로 monocyte로 분화시킨 세포에 lipofectamine RNAiMax reagent를 이용하여, transfection 후, 24 hr 후와 48 hr 후에 세포를 harvest 하여, 수지상 세포의 표면 마커인 CD11c, CD40, CD80, CD86로 염색하여 FACS 분석을 실시. 그러나, microRNAs의 mimic을 이용한 결과는, 안타깝게도 모두 negative 결과 도출.
이러한 결과가 주는 의미에 대해 고려해본 결과,
1. 미성숙 수지상세포에 microRNAs의 transfection efficiency를 고려하지 않았음.
2. microRNAs의 농도 변화없이, 20 nM의 단일 농도로 실험함.
3. MICRORNA transfection 후 유전자 발현 최대 시간인 72 시간을 고려하지 않았음.
따라서, 본 연구자는 이러한 세가지의 문제점을 고려하여, transfection efficiency를 확인할 수 있는 세포사멸을 유도하는 siRNA를 positive control로 사용하여, transfection efficiency를 최대한 올릴 것이며, 다양한 농도를 이용하여, 24 hr, 48 hr, 72 hr 후의 세포들을 이용하여 차년도 과제 수행 중이었음.
또한, 본 연구를 진행하면서, 연구 수행에 따른 문제점 또한 인지.
선행연구 microRNAarray 결과 분석 시, triplication으로 진행한 샘플중 1개의 샘플이 clustering이 되지않아, data 분석이 duplication으로 실시한 것이었고, 이 결과를 바탕으로 찾은 microRNAs의 real time PCR 결과와 microRNAarray fold 차이가 상의 한 것을 확인함. 따라서 더욱 정확한 실험 결과 도출을 위해, 마우스 BMDC를 다시 분리하여 면역관용 수지상 세포의 time point 0, 4, 24 시간으로 간소화함과 동시에, microRNA array라는 단일 방법이 아닌, gene array도 함께 진행하여, gene-microRNA의 비교 분석이 가능하도록 계획하여 추진 중이었음.
(출처:요약문 4p)
목차 Contents
- 표지 ... 1목차 ... 3Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5 1. 연구과제의 개요 ... 5 2. 국내외 기술개발 현황 ... 6 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 7 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 10 5. 연구결과의 활용계획 ... 10 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 10Ⅲ. 연구성과 ... 11끝페이지 ... 11
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