초록 ▼

Tumor vaccine은 tumor에서만 선택적으로 발현되는 tumor-associated antigen (TAA)가 존재함으로 해서 가능해진다. 현재까지 알려진 사람의 TAA만해도 400여 가지에 이르며 그 수는 계속해서 증가하고 있다 (http://cancerimmunity.org/v13p15/).
초기 tumor immunotherapy에는 TAA에서 유래되는 peptide를 환자에 직접 투여하여 TAA-specific한 T 세포의 활성화를 유도하는 방법이 사용되었으나 만족할 만한 임상 결과를 얻을 수 없었다. 그 다음

Tumor vaccine은 tumor에서만 선택적으로 발현되는 tumor-associated antigen (TAA)가 존재함으로 해서 가능해진다. 현재까지 알려진 사람의 TAA만해도 400여 가지에 이르며 그 수는 계속해서 증가하고 있다 (http://cancerimmunity.org/v13p15/).
초기 tumor immunotherapy에는 TAA에서 유래되는 peptide를 환자에 직접 투여하여 TAA-specific한 T 세포의 활성화를 유도하는 방법이 사용되었으나 만족할 만한 임상 결과를 얻을 수 없었다. 그 다음으로 T 세포의 활성화에 결정적인 역할을 하는 DC를 이용하는 방법이 개발 되었다. 즉, TAA가 탑재된DC를 암환자에 투여하는 방법이 시도되었는데 이 방법의 임상 결과는 비교적 양호하여 항암면역치료제로서의 한 가지 영역으로 확립되어 가고 있다. 하지만 환자의 혈액으로부터 DC를 분리하여야 하고 많은 수의 DC를 확보하기 위해 상당 기간 배양하여야 하는 번거로움이 있을 뿐만 아니라 보관상의 문제와 고가의 생산 비용 등은 극복해야 하는 과제이다.
본 연구의 주목표는 Dros S2 APC의 세포막으로부터 제조한 pMV를 tumor vaccine으로 응용하는 기 술의 확립에 있다. 이를 위해 기초가 되는 면역학적 이론의
proof-of-concept을 위한 연구를 수행하며 아울러 vaccine의 효능 증진과 실용화를 위한 기술 개발에 그 목적을 둔다. 우선 CD8+ T 세포의 활성화에 필수적으로 요구되는 쥐나 사람의 MHCI을 위시하여 엄선된 보조 면역증진 분자들을 발현하는 Dros APC를 확립하고 이들 APC로부터 pMV를 제조한다. 제조된 pMV에 암세포에 존재하는 TAA로부터 유래되는 peptide를 탑재시킨다. 그 다음 MHC-peptide complex의 안정성을 증진시킬 목적으로 peptide가 탑재된 pMV를 paraformaldehyde(PFA)로 처리하여 모든 단백질들을 고정화(fixation)시키고 PFA는 투석(dialysis)을 통해 제거한다. 고정화된 pMV의 T 세포 활성화를 위한 효능 검사는 쥐를 이용한 in vivo 실 험과 쥐에서 분리한 primary T 세포를 이용한 in vitro 실험계를 통해 수행한다. 다음으로 위의 방법으로 제작된 pMV의 항암면역제제로의 유용성을 쥐를 이용한 tumor model을 통해 검증한다.

1. Breeding of Congenic (CD45.1, Ly5.1) 2C TCR Tg mice
2C TCR transgenic mouse를 일본 RIKEN 동물자원 연구소롤부터 구입하여 충남대학교 공동동물실에 colony를 확립하였음. 또한 CD45.1 maker를 발현하는 B6.CD45.1 mouse를 미국의 Jaclson Lab으로부 터 구입하여 서로 congenic한 관계에 있는 2C.CD45.1과 2C.CD45.2를 각각 확립함으로써 adoptive transfer를 통한 동물실험의 기반을 확립하였음.
2. Construction of New Dros APCs
Ld 마우스 MHCI만을 과 발현하는 Dros APC를 제조하기 위해 S2 세포주를 미국의 Invitrogen (Thermo-Fischer)사로부터 구입하여 배양하였다. expression vector로 사용한 pMT/V5-His plasmid를 같은 회사로부터 구매하여 사용하였다. MHCI은 MHCI과 b2m의 두 가지 단백질로 구성되어 있는 heterodimer이기 때문에 Ld를 발현하는 쥐의 비장 세포에서 RNA를 분리한 다음 RT-PCR 과정을 거처 Ld와 b2m을 coding하는 cDNA를 합성하고 이들을 pMT/V5-His vector에 각각 cloning하였다. cloning된 유전자들의 염기 서열은 sequencing을 이용하여 확인하였다.
3. Determining T cell stimulatory activity of pMVs in vivo
새로 제작한 Ld Dros APC를 대량 배양하고 배양된 세포로부터 Ld를 발현하는 pMV를 제조하였다. 제조된 pMV에 QL9 peptide와 p2Ca peptide를 각각 처리하여 Ld/QL9 과 Ld/p2CA 형성을 유도한 다음 이들을 PFA로 처리하여 고정화 시키고 남아있는 PFA는 투석을 통해 제거한 후 동물실험에 사용하였다. 동물 실험 결과 PFA 고정화에 의한 Ld/p2Ca의 T 세포 활성화의 향상을 확인할 수 있었음.
4. Studies for probing effects of PFA fixation on the immuno-stimulatory activities of Dros pMVs
PFA 고정화의 효과를 구체적으로 이해하기 위해 다양한 in vitro T cell activation 과정들을 시간 별로 탐구하였는데 초기 활성화 현상들과는 달리 p2Ca 탑재 pMV에 의한 later T 세포 활성화 현상의 유도를 위해서는 PFA에 의한 pMV (Ld/p2Ca)의 고정화가 필수적으로 요구된다는 것을 알 수 있었다. p2C와는 달리 QL9이 탑재된 pMV의 경우는 in vivo 동물실험에서와 같이 고정화에 의한 활성 증진 효과가 크지 않음을 알 수 있었다. 이러한 실험 결과들을 종합해 보면 기존에 알려져 있는 데로 Ld/p2Ca complex의 2CTCR에 대한 binding affinity는 Ld/QL9 complex와 비교하여 그리 큰 차이가 없는 것으로 보이며 따라서 초기 T 세포 활성화 과정은 순조롭게 진행되나 시간이 지나면서 Ld/p2Ca의 낮은 안정성으로 인해 p2Ca가 Ld로부터 분리되고 따라서 활성을 잃어버림으로서 후기 T 세포 활성화까지 유도하지 못하는 현상이 나타나는 것으로 사료된다. 이러한 낮은 안정성의 문제는 PFA에 의한 Ld/p2Ca complex의 고정화(covalent cross-linking)에 의해 현저히 개선되는 것으로 판단된다.
(출처:요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1목차 ... 2Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5 1. 연구과제의 개요 ... 5 2. 국내외 기술개발 현황 ... 8 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 10 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 13 5. 연구결과의 활용계획 ... 13 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 13Ⅲ. 연구성과 ... 13끝페이지 ... 13