보고서 정보
주관연구기관 |
성균관대학교 SungKyunKwan University |
연구책임자 |
권석태
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2016-06 |
과제시작연도 |
2015 |
주관부처 |
미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning |
등록번호 |
TRKO201700013555 |
과제고유번호 |
1711029191 |
사업명 |
신진연구자지원 |
DB 구축일자 |
2017-11-18
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키워드 |
나노아케움 이퀴탄스.DNA 중합효소.Neq HS DNA 중합효소.인테인.인테인 스플라이싱.중합효소 연쇄반응.핫-스타트 PCR.써모코커스 바로필러스 Ch5.Tba5 DNA 중합효소.Nanoarchaeum equitans.DNA polymerase.Neq HS DNA polymerase.intein.intein splicing.polymerase chain reaction (PCR).hot-start PCR.Thermococcus barophilus Ch5.Tba5 DNA polymerase.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201700013555 |
초록
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□ 연구의 목적 및 내용
Nanoarchaeum equitans (Neq) DNA 중합효소는 N-말단 부분 (Neq L)과 C-말단부분 (Neq S)이 각각 미니 인테인을 갖고 있는 분할된 2개의 유전자로 암호화되어 있다. 이들 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 혼합했을 때 고온에서만 인테인 트랜스 스플라이싱이 일어나기 때문에 핫-스타트 (HS) PCR에 처음으로 적용하였다. 그러나, NeqL 단편과 Neq S 단편들을 각각 별도로 정제하여야 하고, 또 정확한 동량을 PCR 반응액에 첨가해야하는 문제점이 있다. 본 연구에서
□ 연구의 목적 및 내용
Nanoarchaeum equitans (Neq) DNA 중합효소는 N-말단 부분 (Neq L)과 C-말단부분 (Neq S)이 각각 미니 인테인을 갖고 있는 분할된 2개의 유전자로 암호화되어 있다. 이들 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 혼합했을 때 고온에서만 인테인 트랜스 스플라이싱이 일어나기 때문에 핫-스타트 (HS) PCR에 처음으로 적용하였다. 그러나, NeqL 단편과 Neq S 단편들을 각각 별도로 정제하여야 하고, 또 정확한 동량을 PCR 반응액에 첨가해야하는 문제점이 있다. 본 연구에서는 위의 문제를 해결하기 위해, Neq DNA 중합효소의 인테인 유전자를 하나로 연결시킨 Neq HS (hot-start) DNA 중합효소를 만들었다. 구축돤 돌연변체 Neq HS DNA 중합효소들을 고온에서 인테인 스플라이싱에 의한 다양한 핫-스타트 PCR에 응용하였다. 또 Neq DNA 중합효소의 스플라이싱 부위의 아미노산들을 치환시켜 단백질 스플라이싱 기작을 분석하였다. 한편으로 Ignicoccus hospitalis KIN4/I (Iho) 및 Thermococcus barophilus Ch5 (Tba5) DNA 중합효소들의 특성을 각각 연구하였다.
□ 연구결과
Neq L 단편과 Neq S 단편이 서로 연결된 Neq HS DNA 중합효소를 제조하였다. 이들 연결된 인테인 서열은 단백질 스플라이싱에 의해 절단되면서 동시에 두 익스테인(인테인을 제외한 나머지 부분)들이 결합되어 활성형 Neq DNA polymerase를 만든다. PCR 증폭속도 및 증폭레벨이 증가된 3가지 돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소(M1, M2, M3)들을 구축했다. 인간 지놈 DNA의 다양한 타깃 단편들을 증폭했을 때, Neq HS M3 DNA 중합효소가 상업적으로 이용 가능한 Taq 및 Pfu DNA 중합효소들 보다 비특이적 산물의 증폭없이 선택적으로 증폭되었다. 그러므로 Neq HS M3 DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱이 노벨 핫-스타트 PCR을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
대부분의 인테인들의 분석은 스플라이싱에 필요한 아미노산 잔기들이 인테인/익스테인서열의 접합부위 (junction)에서 잘 보존되어 있다. 이들 스플라이싱 접합 부위에 있는 아미노산들 (Asp 578, Ser 579 and Thr 713)의 단백질 스플라이싱에 대한 역할에 초점을 맞추어 다양항 돌연변이체를 구축하였다. 그러나, 돌연변이체 T723S를 제외한 모든 돌연변이체들에서 94 kD 스플라이싱 산물을 관찰할 수 없었다. 따라서 스플라이스 접합부위에 있는 이들 잔기들이 스플라이싱에 중요한 역할을 수행할 수 도 있다.
별개의 연구로 Nanoarchaeum equitans 균주가 기생하는 숙주균주인 Ignicoccus hospitalis KIN4/I (Iho)의 Iho DNA 중합효소와 Thermococcus barophilus Ch5 (Tba5)의 Tba5 DNA 중합효소의 특성을 연구하였다. 흥미로운 것은 이 Tba5 DNA 중합효소 유전자는 2,065 아미노산 잔기를 인코드하는 6,198 염기의 열린해독틀 (ORF)을 갖는 거대한 전구체로 만들어져서3개의 인테인들이 절단과 동시에 엑시테인들이 결합되어 활성형 Tba5 DNA 중합효소가 된다.
□ 연구결과의 활용계획
핫-스타트 PCR은 감염성 질병의 동정 (예, HIV), 낮은 수준의 정제된 DNA 증폭, 리얼타임 PCR, 원스텝 RT-PCR과 같은 다양한 분야에 사용된다.
돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소들은 상업적으로 이용할 수 있는 Taq, HSTaq, Pfu DNA 중합효소들과 PCR 효율을 비교했을 때 보다 비특이적 산물의 증폭 없이 고도로 정확하게 원하는 DNA 단편을 선택적으로 증폭하였다.
그러므로 Neq HS DNA 중합효소는 유전공학 실험, 임상진단, 법의학연구 등을 포함한 다양한 분야에 Taq 및 Pfu DNA 중합효소들보다 더 유용하게 사용될 수 있다.
(출처:요약문 4p)
Abstract
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□ Purpose& contents
Nanoarchaeum equitans (Neq) DNA polymerase is encoded by two separate genes, the N-terminal part (Neq L) and the C-terminal part (Neq S), including a split mini-intein sequence. We have first applied to hot-start (HS) PCR using Neq L and Neq S fragments, because the protein tr
□ Purpose& contents
Nanoarchaeum equitans (Neq) DNA polymerase is encoded by two separate genes, the N-terminal part (Neq L) and the C-terminal part (Neq S), including a split mini-intein sequence. We have first applied to hot-start (HS) PCR using Neq L and Neq S fragments, because the protein trans-splicing of these mini-intein sequences were occurred only a high temperature. However, the method has problems in that the Neq L and Neq S fragments should be separately purified, and be added to a PCR reaction solution at accurate equimolar concentrations. In this study, to solve the above problem, we have developed Neq hot-start (HS) DNA polymerase, in which inteins of a Neq L fragment and a Neq S fragment are linked with each other. The constructed mutant Neq HS DNA polymerase apply for various hot-start PCR. We also try to analysis of protein splicing by the substitution of amino acids in splicing junction of Neq DNA polymerase. The analysis and properties of Iho DNA polymerase and Tba5 DNA polymerase were studied separately.
□ Result
We have developed Neq HS DNA polymerase, in which inteins of a Neq L fragment and a Neq S fragment are linked with each other. These fused intein sequence was removed through protein splicing process and the exteins (the remaining portions) are simultaneously joined to yield the mature Neq DNA polymerase. We also screened three mutant Neq HS polymerases (M1, M2, and M3) having a highly improved PCR amplification rate and amplification level. When various target fragments of human genomic DNA are amplified, the Neq HS M3 DNA polymerase have selectively amplified a target DNA without amplification of non-specific products, compared to the commercially available Taq and Pfu DNA polymerases. Therefore, we showed that the protein splicing of Neq HS M3 DNA polymerase can provide a novel hot-start for PCR.
Analysis of most inteins showed that amino acid residues required for splicing are conserved at the junction of the intein/extein sequence. We focused on the possible role of residues Asp 578, Ser 579 and Thr 713 of the junction of the intein/extein sequence for protein splicing. We constructed several mutants. However, the 94 kDa spliced product was not observed in all the mutant enzymes except the mutant T713S. Thus, these residues at splice junctions may perform important role for intein splicing.
We studied the properties of Iho DNA polymerase from Ignicoccus hospitalis KIN4/I. Interestingly, I. hospitalis KIN4/I is the host organism for Nanoarchaeum equitans. We also studied that the properties of Tba5 DNA polymerase gene contains an open reading frame (ORF) of 6,198 bases that encodes 2,065 amino acid residues. Interestingly, the gene is split by three inteins that must be spliced out to form the mature DNA polymerase.
□ Expected Contribution
The hot-start PCR has been used in various fields such as identification of infectious diseases (e.g., HIV), amplification of DNA with low purity, real-time PCR, one-step RT-PCR.
The mutant Neq HS polymerases have an excellent effect of selectively amplifying DNA of interest with high accuracy without amplification of non-specific products, compared to the commercially available Taq, HSTaq and Pfu DNA polymerases.
Therefore, Neq HS DNA polymerase may be more effective than Taq and Pfu DNA polymerases in applications in various fields including genetic engineering and molecular biology experiments, clinical diagnosis, forensic studies, etc.
(출처:SUMMARY 5p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 목차 ... 2
- 연구계획 요약문 ... 3
- 연구결과 요약문 ... 4
- 한글요약문 ... 4
- SUMMARY ... 5
- 연구내용 및 결과 ... 6
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 9
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 10
- 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 35
- 5. 연구결과의 활용계획 ... 37
- 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 37
- 7. 참고문헌 ... 38
- 8. 연구성과 ... 40
- 9. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설.장비 현황 ... 42
- 10. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 42
- 11. 기타사항 ... 43
- 끝페이지 ... 43
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