초록 ▼

1. Cas 단백질의 생산법 확립
Cas 단백질의 분자 구조 및 기능 등 특성 분석과 상호 작용 및 복합체 형성 등을 연구하기 위해, 분석 방법에 적당한 양과 질의 Cas 단백질 준비가 필수적이며, 이를 위한 Cas 단백질 생산법을 확립하였음.
1) Cas 단백질 유전자의 Cloning
연구 대상 세균 또는 Genomic DNA로부터 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 후 단백질 발현에 적합한 Vector에 Cloning을 수행함.
2) Cas 단백질의 발현, 분리 및 정제
Cas 단백질을 대장균에서 과다

1. Cas 단백질의 생산법 확립
Cas 단백질의 분자 구조 및 기능 등 특성 분석과 상호 작용 및 복합체 형성 등을 연구하기 위해, 분석 방법에 적당한 양과 질의 Cas 단백질 준비가 필수적이며, 이를 위한 Cas 단백질 생산법을 확립하였음.
1) Cas 단백질 유전자의 Cloning
연구 대상 세균 또는 Genomic DNA로부터 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 후 단백질 발현에 적합한 Vector에 Cloning을 수행함.
2) Cas 단백질의 발현, 분리 및 정제
Cas 단백질을 대장균에서 과다 발현하고 Chromatography를 중심으로 한 다양한 단백질 정제 기술을 이용하여 분리 및 정제함.

2. Cas 단백질의 분자 구조 및 기능 규명
인간 및 식물 병원균의 CRISPR-Cas system에서 Cas 단백질 복합체를 형성하는 Cas 단백질의 분자 구조 및 기능을 구조생물학 및 생화학적 분석법을 이용하여 규명하였음.
1) Streptococcus pyogenes Cas2 단백질의 결정 구조 및 dsDNA nuclease 활성 규명
인간 병원균인 화농성연쇄구균 (S. pyogenes) 내 Type I CRISPR-Cas system의 구성요소인 Cas2 단백질의 결정 구조와 dsDNase 활성을 규명하고 분석하였음.
2) Xanthomonas oryzae Cas2 단백질의 dsDNA nuclease 활성 규명
벼흰잎마름병균 (X. oryxae) 내 Type I Cas2 단백질의 dsDNase 활성을 규명하고 분석하였음.
3) S. pyogenes Cas1 단백질의 결정 구조 규명
S. pyogenes의 Cas1 단백질의 결정 구조를 규명하였음. 이는 Type II Cas1 단백질 분자 구조에 대한 최초의 보고로서, Cas1 기능의 Conformational activation 가능성을 제시.

3. Cas 단백질 복합체 (Complex) 형성 규명 및 상호작용 분석
S. pyogenes Type II CRISPR-Cas system은 최근 혁신적 유전체 편집 도구로 각광받고 있는 Cas9 단백질을 포함하여 총 4종의 Cas 단백질들 (Cas1, Cas2, Cas9, Csn2)로 구성되어 있음. 과제 연구 수행을 통해 이들 4종 Cas 단백질들이 하나의 복합체를 구성함을 규명하였고 (그림 1), 개별 Cas 단백질 간의 상호작용 네트워크 및 부분복합체(Subcomplex) 형성을 분석하였음.
1) Cas1-Csn2 상호작용 및 부분복합체 형성 규명
Co-expression에 이은 Co-purification 실험, Size-exclusion chromatography (SEC) 및 Isothermal titration calorimetry (ITC)를 통해 Cas1과 Csn2 단백질이 정전기적 상호작용을 통해 부분복합체를 형성함을 규명하였음.
2) Cas1-Cas2 및 Cas9-Csn2 상호작용 및 부분복합체 형성 규명
다양한 실험 방법을 이용하여 Cas1-Cas2 및 Cas9-Csn2 부분복합체 형성을 규명하였음.

4. Cas 단백질 복합체의 구조 분석
계산 (Computational) 및 실험적 (Experimental) 접근법을 상호보완적으로 이용하여 결론 도출을 극대화 하였으며, 이를 기반으로 Cas 단백질 부분복합체의 구조적 특성을 분석함.
1) Cas1-Csn2 부분복합체의 구조 분석
서울대 석차옥 교수 연구팀과의 공동연구를 통해 S. pyogenes type II Cas1 및 Csn2 단백질의 in silico docking simulation을 수행하였고, 이를 바탕으로 Cas1-Csn2 부분복합체의 입체 구조 모델을 제시하고, 상호작용에 중요한 아미노산 잔기들을 예측하였음 (그림 2). 이러한 계산과학적 분석 결과들을 Site-directed mutagenesis를 통한 돌연변이 Cas 단백질들의 생산과 이를 이용한 상호작용 분석 및 복합체 형성 여부 시험을 통해 실험적으로 검증하였음.
(출처:요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 7
• Ⅲ. 연구성과 ... 8
• 끝페이지 ... 10