초록 ▼

세균의 항생제에 대한 내성은 크게 저항성(resistance)과 존속성(persistence)으로 구분할 수 있다. 저항성은 항생제에 대한 내성이 유전자를 통하여 유전되며 horizontal gene transfer 등을 통하여 다른 세균으로 전이될 수 있다. 반면에 존속성은 내성 형질이 유전되지 않고 확률적으로 나타난다. 세균의 0.001~1%에 이르는 subpopulaiton은 어떠한 항생제를 아무리 높은 농도로 처리하여도 죽지 않고 살아나며, 이들은 항생제가 없어지고 나면 동일한 비율의 subpopulation의 persist

세균의 항생제에 대한 내성은 크게 저항성(resistance)과 존속성(persistence)으로 구분할 수 있다. 저항성은 항생제에 대한 내성이 유전자를 통하여 유전되며 horizontal gene transfer 등을 통하여 다른 세균으로 전이될 수 있다. 반면에 존속성은 내성 형질이 유전되지 않고 확률적으로 나타난다. 세균의 0.001~1%에 이르는 subpopulaiton은 어떠한 항생제를 아무리 높은 농도로 처리하여도 죽지 않고 살아나며, 이들은 항생제가 없어지고 나면 동일한 비율의 subpopulation의 persister를 남긴다. 이러한 현상은 난치성 감염성 질환의 주요 원인이 될 뿐만 아니라, 저항성세균으로의 발전의 전단계로 여기지고 있으나 이에 대한 연구가 매우 미흡한 상황이었다.
본 연구에서는 먼저 존속성의 기전을 규명하고자 하였다. 존속성에 영향을 미치는 유전자를 탐색하기 위하여 E. coli의 유전체 절편 라이브러리를 구축하였고, 이를 통하여 fumarate reductase operon (frdABCD, FRD)이 과발현되면 존속성균의 늘어남을 알았다. Fumarate가 외부에서 첨가되면 세포내의 fumarate 농도가 증가하게 되고 존속성균이 크게 늘었다. Succinate dehydrogenase (SDH)는 fumarate를 생산함으로써 존속성 형성에 영향을 주는 것을 확인하였다. SDH를 KO시키면 존속성이 거의 완전히 사라지는 것을 확인하였다. FRD의 기질이면서 SDH의 생산물인 fumarate가 존속성 형성에 공통적인 매개체로 작용을 할 수 있는 가능성을 확인하였다. TCA cycle intermediates를 첨가하거나 유전자의 KO 및 과발현을 통하여 intracellular fumarate의 농도 변화를 유도한 이후에 존속성 형성비율을 조사하였더니 둘 사이의 상관관계가 매우 높게 나타났다. 즉 intracellular fumarate의 농도가 증가한 경우 존속성 형성비율이 증가했음을 알 수 있었다. Fumarate 연관 존속성 출현이 hydroxyl radical의 형성과 관련이 있는지 확인하였다. Hydroxyl radical의 생성이 감소되면 존속성 세균이 많이 감소한다는 것을 확인하였으며 이러한 현상이 fumarate를 첨가하였을 때도 일어나는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과들을 통하여 존속성이 전자전달계에서 fumarate를 사용하여 anaerobic respiration하고 hydroxyl radical의 생성을 억제함으로 생겨난다는 결론을 얻을 수 있었다. 또한 intracellular fumarate의 농도를 낮게 만듦으로써 존속성으로 인한 난치성 감염성 질환을 치료할 수 있는 방법을 제시하였다.
세균의 항생제에 대한 저항성을 극복하는 다양한 기술들이 개발되고 있다. 이는 신규항생제의 개발이 매우 더디게 진행되는 상황에서 기존의 항생제를 이용하여 저항성 세균을 사멸하는 기술에 관한 것이다. 최근 개발된 유전자 편집기술인 CRISPR/Cas9을 이용하면 세균에서 저항성 유전자를 제거할 수 있다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 extended-spectrum 􌩁-lactamases (ESBLs) 유전자 제거 기술을 개발하였다. 이를 RESAFR (Re-sensitization of Antibiotic resistance) 시스템이라 명명하고 그 효과를 증명 하였다. 그리고 더 나아가 RESAFR 시스템에 의해 bla 유전자와 함께 bla 유전자가 포함된 플라스미드 전체가 분해되어 제거될 수 있음을 확인 하였다. ESBL에는 TEM, SHV등을 포함하여 그룹당 200여종 이상의 돌연변이들이 보고되어 있는데, CRISPR/Cas9이 아무리 효과적이라고 하더라도 수백종 이상의 돌열변이 유전자들을 모두 타겟으로 할 수는 없다. 이에 본 연구에서는 ESBL들을 발현하는 E. coli 에 포괄적으로 RESAFR 시스템을 적용하기 위해 ESBLs의 여러 돌연변이 염기서열들을 조사하여 ESBLs의 여러 그룹 중 TEM과 SHV 내성 그룹에서 돌연변이에 관계없이 공통으로 존재하는 염기서열들을 발견하였다. 이러한 염기서열은 PAM sequence를 포함하여 CRISPR/Cas9으로 제거가 가능하다. 이 공통서열을 표적으로 하는 RESAFR 시스템을 만들어 이 시스템이 TEM-1 내성 유전자를 제거 할 뿐만 아니라 앞에서 확인한 봐와 같이 TEM-1 내성 유전자가 포함된 플라스미드 전체를 제거할 수 있음을 확인하였다. 여기에 RESAFR 시스템의 전달을 위한 phage 시스템을 고안하여 플라스미드 형태로 수평적 유전자 전달 방식을 통해 이종 간에도 쉽게 전파될 수 있는 여러 내성 유전자들을 동시에 제거할 수 있는 메커니즘을 제시하였다.
(출처: 연구결과 요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 4
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 8
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 8
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 8
• Ⅲ. 연구성과 ... 9
• 끝페이지 ... 13