초록 ▼

본 연구에서는 NsdD 단백질이 핵으로 이동하는 과정과 단백질의 안정성이 분화조절과 관련이 있는 지를 조사하고자 하였다. NsdD가 핵으로 이동하는데 NLS 및 Zn finger가 젓요한 역할을 하는가를 확인하고 유성분화가 억제되는 스트레스조건 및 촉진되는 조건등에서 핵으로 이동이 영향을 받는가 조사하며 아울러 NsdD 결합단백질인 IndBD가 NsdD의 핵이동을 방해하는 지를 알아본다. 또한 nsdD의 전사에 별 영향을 주지 못하는 것으로 알려진 분화조절 유전자 veA, nsdC등 능동조절유전자가 NsdD 핵이동에 미치는 영향을

본 연구에서는 NsdD 단백질이 핵으로 이동하는 과정과 단백질의 안정성이 분화조절과 관련이 있는 지를 조사하고자 하였다. NsdD가 핵으로 이동하는데 NLS 및 Zn finger가 젓요한 역할을 하는가를 확인하고 유성분화가 억제되는 스트레스조건 및 촉진되는 조건등에서 핵으로 이동이 영향을 받는가 조사하며 아울러 NsdD 결합단백질인 IndBD가 NsdD의 핵이동을 방해하는 지를 알아본다. 또한 nsdD의 전사에 별 영향을 주지 못하는 것으로 알려진 분화조절 유전자 veA, nsdC등 능동조절유전자가 NsdD 핵이동에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 먼저 위 연구를 위해 다양한 유전적 배경에 NsdD-GFP 융합 단백질을 지니는 균주 분리하였다. 이들 균주들을 이용하여 다음과 같은 결과를 얻어내었다.

1. 생활사의 각 단계에서 GFP 형광을 conforcal microscope로 관찰한 결과 발아후 12시간이후에 핵에서 신호가 발견되었고 이는 16시간전후에 대부분의 균사에서 발견되었다. 이 신호는 20시간이후에 핵에서 소멸되었고 분화된 세포에서는 더 이상 관찰되지 않았다. 이 결과는 NsdD가 생장 특정 시점에 주로 핵으로 이동함을 나타내며 이 시기는 NsdD가 분화의 방향을 결정하는 젓요 시점임을 시사한다.

2. A. nidulans는 생장에 영향을 주는 여러 스트레스는 nsdD 유전자의 전사에는 별 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 KCl, NaCl과 같은 salt 스트레스 및 1.2M sorbitol의 삼투스트레스 또는 acetate가 유일탄소원인 조건에서 배양한 균사에서는 발아후 16시간대에도 NsdD가 핵에서 발견되지 않았을 뿐만 아니라 세포질에서도 관찰되지 않았다. 이는 NsdD의 발현이 스트레스에 대해 전사단계에서는 영향을 받지 않지만 해독이나 단백질의 핵이동과정이 스트레스와 관련이 있음을 시사한다.

3. NsdD가 핵으로 들어가기 위해서는 NLS 가 젓요한 역할을 하지만 필수적이지는 않다는 것을 알수 있었다. 이들 돌연변이에서 nsdD 의 target gene인 nrsA 의 발현이 증가하는 것으로 보아 NLS 를 통한 NsdD 핵이동이 유전적 조절을 하고 있음을 보여준다.

4. NsdD의 Zn finger의 첫 번째 cystein이 phenylalanine으로 치환된 돌연변이는 핵으로 정상적으로 들어갔다. 이는 Zn finger 가 NsdD의 핵으로 이동하는 과정에 관여하지 않음을 나타낸다.

5. N terminal 부위가 결여된 NsdD는 단백질이 세포질 전체에 진하게 퍼져있어 핵으로의 이동을 구분할 수가 없었지만 일부 균사에서 DAPI 염색부위와 젓복되는 부분이 관찰되어 핵으로 이동은 일어나는 것으로 보인다. 이 돌연변이 단백질이 세포질 전체에 분포하는 것은 분해되지 않았기 때문으로 추정되며 이 단백질이 핵으로 이동되지 못한 단백질이 제거되는데 N terminal 서열이 젓요함을 보여주고 있다.
western 결과 N terminal 결실된 단백질은 핵과 세포질에 다량으로 존재함이 이를 지지한다

6. NsdD의 Zn finger에 결합하여 NsdD의 유성분화조절을 방해하여 유성분화를 저해하는 것으로 추정되는 IndB/D 단백질은 NsdD의 핵이동을 방해한다. IndB 또는 IndD가 정상으로 발현되었을 경우 NsdD가 주로 핵에서 관찰이되었으나 IndB가 과다발현되었을 때에는 발아후 12시간이후의 균사에서 대부분의 NsdD가 세포질에 존재함을 볼 수 있다. IndD가 과다발현되었을 경우에도 NsdD 단백질이 핵보다는 세포질에서 많이 관찰되었다. 이와 같은 결과는 IndB 또는 IndD가 세포질에서 NsdD의 Zn finger에 결합하여 NLS 부위를 shielding 함으로써 NsdD의 핵이동을 저해하고 있음을 보여준다. IndD가 과다발현된 균주에서 NsdD-C400F 는 정상적으로 핵으로 이동하였다. 이 결과는 IndD가 NsdD-C400F의 Zn finger에 결합하지 못해 NLS 부위가 노출되어 핵으로 이동하였음을 보여준다. 6. NsdD 단백질의 핵이동을 단백질 수준에서 확인하기 위해 핵과 세포질 단백질을 각각 분리하여 GFP의 항체로 추적하였다. GFP-NsdD 융합단백질의 분자량은 76kDa 인데 핵과 세포질에 경우에 따라 49kDa와 27kDa 크기의 polypeptide가 관찰되는데 불활성화된 NsdD 단백질로 추정된다. 다양한 스트레스 조건에서 NsdD 단백질의 안정성 (stability)의 문제가 발생되고 있으며 2% acetate 조건에서 NsdD 단백질은 핵에 전혀 이동을 못하는 것을 확인하였다.

7. veA 결손돌연변이 균주에서 NsdD 단백질이 핵이동 능력이 떨어짐으로 인해 세포질에 주로 존재하였고, 핵 내에서는 NsdD 단백질 양이 감소하였다. 이 결과를 통해서 NsdD 단백질이 핵이동에 있어서 VeA가 필요할 것이라는 예상을 할 수 있다. 세포질에 존재하는 NsdD 단백질은 NsdD의 N-terminal 부위가 degradation이 되면서 형성될 것이라 예상되는 사이즈 (49kDa, 27kDa) 및 심하게 끌림 (smearing)현상이 관찰되는 바 NsdD 단백질의 안정성을 유지 및 NsdD 단백질이 핵이동을 하기 위해하기 위해서 VeA가 반드시 필요하다고 사료된다.

(출처 : Ⅰ. 연구결과 요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ.연구결과요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 6
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 6
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 6
• Ⅲ. 연구성과 ... 7
• 끝페이지 ... 7