초록 ▼

〇 연구목표
〇 Agrobacterium tumefaciens mediated transformation 방법과 Particle Bombardment 방법을 버섯에 접목하여 인간 유용단백질을 생산할 수 있는 새로운 버섯형질전환 시스템을 개발.
〇 우리의 전통적인 농산물 먹거리인 버섯을 이용한 재조합 단백질 기능성식품소재 생산에 이용하여 부가가치 창출 및 최종적으로 농가 소득에 이바지함.
〇 개발 유용단백질의 물질 및 용도특허, 버섯생산시스템 용도특허，유용단백질 대량생산기술 용도특허 등 2건 이상의 특허 출원，생산단백

〇 연구목표
〇 Agrobacterium tumefaciens mediated transformation 방법과 Particle Bombardment 방법을 버섯에 접목하여 인간 유용단백질을 생산할 수 있는 새로운 버섯형질전환 시스템을 개발.
〇 우리의 전통적인 농산물 먹거리인 버섯을 이용한 재조합 단백질 기능성식품소재 생산에 이용하여 부가가치 창출 및 최종적으로 농가 소득에 이바지함.
〇 개발 유용단백질의 물질 및 용도특허, 버섯생산시스템 용도특허，유용단백질 대량생산기술 용도특허 등 2건 이상의 특허 출원，생산단백질의 산업화 등 개발기술의 농업관련회사 및 농가에 기술이전.

〇 연구내용
〇 산업화 가능한 유용단백질 선정 및 유용유전자 확보
〇 Vacuum infiltration 및 Particle bombardment 방법을 이용한 버섯형질전환방법 확립
〇 형질전환체 선별방법 및 검증방법 확립
〇 재조합 DNA 제작
〇 고발현 숙주 특이적 발현 벡터 개발
〇 맞춤형 발현시스템 개발
〇 형질전환체 / 형질전환 균사체 및 자실체 배양 및 검증
〇 형질전환 균사체 및 자실체 대량 배양체계 확립
〇 생산단백질 정제
〇 대량생산 체계 확립 및 품질관리방안 검토
〇 시제품제작 및 참여기업이나 관련 기업으로의 기술이전 등을 통한 산업화

〇 연구개발에 따른 기대성과
기술적 측면
〇 버섯을 이용한 유용단백질 생산시스템개발로 기존 미생물생산시스템 대체 및 산업화 모델 제시
〇 다양한 유용단백질의 고생산성 버섯균주 개발 방법 제시
〇 버섯을 통한 단백질생산으로 기능성 단백질식품의 상업화 가능성을 제시
〇 생산단백질의 물질 특허, 이들의 용도 특허 취득

경제·산업적 측면
〇 현재 바이오 신소재로 각광받고 있는 유용단백질 소재는 산업분야에서는 기술개발의 도구 및 최종 제품으로 점차 그 활용 폭을 확대해 나가고 있으며，여러 산업들에 파급효과가 매우 커서，국가 산업 측면에서 중요성이 부각되고 있음.
〇 재조합단백질의 폭발적인 수요증가에 부응하여 버섯을 이용한 유용단백질을 개발하는 것은 독점적 경쟁력을 가지고 있기 때문에 가격 경쟁력을 갖추고 있으며，방대한 시장규모와 기존 제품들이 가지고 있는 문제점에 비추어 볼 때 국가 차원의 커다란 수익을 창출 할 수 있음.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

· The binary vector, pCAMBIA1304 was used for the initial transformation. The human gene (hGH2, hIL32, hPDGF) was inserted into pCAMBIA1304. There sultant plasmid pCAMBIA1304-hGH2, hIL32, hPDGF was subsequently introduced into frui仕ng bodies of P. eryngii using Agrobacterium tumefaciens strain GV310

· The binary vector, pCAMBIA1304 was used for the initial transformation. The human gene (hGH2, hIL32, hPDGF) was inserted into pCAMBIA1304. There sultant plasmid pCAMBIA1304-hGH2, hIL32, hPDGF was subsequently introduced into frui仕ng bodies of P. eryngii using Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 mediated transformation by vacuum infiltration.

· After cultivation of infiltrated samples in darkness for 7-14 days, histochemical GUS assay was carried out. Accumulation of GUS enzyme was not detected in untransformed control sample. The samples transformed with Agrobacterium tumefaciens were shown to express high level of GUS activity.

· Following the dark culture, the tissues infected with Agrobacterium were placed on the selection media containing antibiotics (50ug/mL hygromycin and 100 ug/mL cefotaxime). Genes stably integrated into the mushroom genome were translated under the control of CaMV 35V promoter, resulting in growth of transformants on medium supplemented with hygromycin.

· The mycelia were grown fastly from the putative transformants whereas mycelia were not grown from nontransformed tissues. Out of twenty tissues, only 8-10 tissue pieces regenerated colonies on hygromycin medium. After final selection with hygromycin, we typically maintained a stable hygromycin-resistant culture for weeks to months on a PDA medium without antibiotic selection. After sub-cultured on PDB medium, we obtained the putative transgenic mycelium for further analysis.

· Genomic DNAs of putative transformants and nontransformed host were used as templates for PCR detection with hGH2, hIL32, hPDGF-specific primers, to confirm the integration of hGH2, hIL32, hPDGF gene and amplified product was expected to be 314 bp, 224 bp, 238 bp. The results showed that P. eryngii mycelia contained the hGH2, hIL32, hPDGF insert, that showed the PCR results of samples of randomly selected transformed mycelia, which showed the specific bands as expected and untransformed mycelium which lacked the specific band. A positive control using pCAMBIA1304-hGH2, hIL32, hPDGF as template was also included.

· Southern blot analysis was performed on positive transformants detected by PCR with the hGH2, hIL32, hPDGF gene specific primers as the hybridization probe to confirm the hGH2, hIL32, hPDGF gene integrated into the genomes of transformants. The results showed that DNA samples from all transformants gave specific hybridization signals. This indicated that hGH2, hIL32, hPDGF gene was incorporated into the genomes of transformants.

· To investigate the production of hGH2, hIL32, hPDGF protein in transgenic mushroom, Western blot analysis was carried out using hGH2, hIL32, hPDGF specific polyclonal antibody. The total protein was extracted from the nontransformed and transformed mycelia and loaded on a 12% SDS-PAGE gel and electrophoretically transferred to a PVDF membrane for immunoblotting. The selected mycelia were found to express hGH2, hIL32, hPDGF protein with iden仕cal molecular mass measurements.

· Recombinant hGH2, hIL32, hPDGF protein synthesized in the transgenic mycelia. The results showed that a molecular weight of about 40 kDa, 25 kDa, 32 kDa specific band was observed in transgenic mushroom samples, which was equivalent to the full length commercial hGH2, hIL32, hPDGF protein. Untransformed mycelia protein extract did not react with the anti-hGH2, hIL32, hPDGF. This result confirmed that the hGH2, hIL32, hPDGF in mushroom cells was correctly translated.

· To become a viable recombinant protein production system, P. eryngii, must not only express recombinant protein but that protein must be biologically active in a highly purified state. rhPDGF-BB was purified by affinity chromatography with Ni-NTA Spin columns under denaturated conditions. rhPDGF-BB accumulated to approximately 4.9% of total soluble protein (TSP). The iden仕ty and purity of rhPDGF-BB was established through SDS-PAGE and Western-blot analysis. Coomassie staining of purified rhPDGF-BB revealed a B chain homodimer band at approximately 32 kDa, the expected mass of the hPDGF-BB homodimer. The rhPDGF-BB B chain dimer was also confirmed by immunoreactivity using a specific, commercially available polyclonal antibody. Native rhPDGF-BB is active as a homodimer. P. eryngii expressed hPDGF-BB appears to show homodimerization suggesting proper protein folding.

· Biological activity of the purified rhPDGF-BB was assayed by measuring proliferation of mouse fibroblast NIH-3T3 cells using BrdU incorporation assay. rhPDGF-BB stimulated the proliferation of fibroblast cells dose dependently. All concentrations of rhPDGF-BB resulted in increased in proliferation compared to untreated cells. The calculated EC₅₀ value of P. eryngii expressed hPDGF-BB was 8.49 ng/mL.

· In the measurement of dry mycelia yields for optimum media selection of Pleurotus eryngii transgenic mycelia (1-132, GH, a-GH, PDGF, PCAM BIA-1304, IL32, etc), GMEB was best good at average 1.42g, then comes MCM, YEPD, PDB, DSM, MEB and transformed Weinhold's in that order.

· The yields of mycelia from GMEB media was higher at 1.12~11.2 times than another media, Culture pH of mushroom mycelia showed comparatively high growing process at 5.0~8.0, but below pH 40 was bad. The optimum pH for proliferation of mushroom mycelia was 5.05~6.12.

· In the measurement of mycelial weight from media contained insoluble ingredient, the measurement methods of mycelial weight established by chitin and ergosterol quantitative.

· The calibration curve by chitin and ergosterol quantitative showed high correlation coeffecient(r>0.99, p<0.0001). Calibration curve was explained on mycelial growth rate.

· In the measurement of chi仕n and ergosterol contents in genetic recombination Pleurotus eryngii mycelia, the contents of chitin was 98.4〜109.5 mg/g(average 105.7 mg/g), and ergosterol was 119.87~129.45㎍/100g (average 124.06㎍/100g).

· In the mycelia measurement of genetic recombination Pleurotus eryngii mycelia products incubated during 20days, all strains on brown rice showed comparatively good growing process at 5.1mm/day, and the contents of chitin was average 22.58 mg/g. On the base of previous data, in the converted result of mycelial weight was average 212.88 gm/g.

· The production of trangenic Pleurotus eryngii mycelia was average 4.896g/L. the production of trangenic Pleurotus eryngii mushroom mycelial injected a-GH gene was most higher at 5.255g/L, and non-trangenic Pleurotus eryngii mushroom mycelial was very lower at 4.023g/L.

· The content of solids of mycelium culture filtrate was very highest at 95.38g, when a-GH transgenic plant, but GH transgenic plant appeared to be low at 51.770g.

· The media for mass culture of transgenic mushroom mycelial was a suitable at GMEB media, and application of liquid starter manufacturing methods of Pleurotus eryngii mushroom mycellium was possible.

· Composition of sawdust media for transgenic mushroom fruiting body production was Oregon pine 60%, bit 9%, cottonseed hulls 9% and rice bran 2%.

· Mycellium culture closing day from sawdust media took 24-39 days, especially, culture period of IL-32 appeared a long time at 39 days.

· The form of harvested fruiting body showed not difference according to transgenic mushroom mycelial, and trnasgenic mushroom mycelial compared to non - transgenic mushroom mycelial showed slightly lower at harvest yields, the fruiting body production of non-transgenic mushroom mycelial was many as 162g/bottle, and fruiting body of IL 32 transgenic mushroom mycelial showed to be low as 68g/bottle.

· The average harvest yields (129g/bottle) appeared almost similarly compared to harvest yields (130g/bottel) of Pleurotus eryngii mushroom cultivation farm.

(출처 : SUMMARY 20p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 20
• CONTENTS ... 24
• 목차 ... 27
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 30
• 1절 연구개발의 필요성 ... 30
• 1. 연구개발대상 기술의 경제적·산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 30
• 가. 재조합 유용단백질소재의 경제적 산업적 중요성 ... 30
• 나. 버섯을 이용한 재조합 유용단백질 생산기술 개발의 필요성(그림2) ... 32
• 2. 관련기술에 대한 연구팀의 선행연구결과 ... 34
• 가. 새송이버섯을 이용한 GUS 유전자발현 연구 ... 34
• 나. 항생제 marker를 이용한 형질전환버섯의 선별 ... 35
• 다. 형질전환버섯의 형질전환 유무검증 ... 35
• 라. 새송이 버섯에서 인체유래 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터의 구축 ... 36
• 마. 새송이 버섯에서 인체유래 단백질의 발현 ... 37
• 2절 연구개발의 목표 및 내용 ... 38
• 1. 연구개발의 최종목표 및 성격 ... 38
• 가. 연구개발의 최종목표 ... 38
• 나. 연구개발의 성격 ... 38
• 2. 연차별 연구개발의 목표 및 내용 ... 39
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 42
• 1절 세계적 수준 ... 42
• 2절 국내수준 ... 42
• 3절 국내·외의 연구현황 ... 43
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 44
• 1절 연구범위 및 연구수행 방법 ... 44
• 1. 1차년도 (2008년) ... 44
• 2. 2차년도 (2009년) ... 45
• 3. 3차년도 (2010년) ... 46
• 2절 연구개발의 추진전략·방법 및 추진체계 ... 47
• 1. 연구개발의 추진전략·방법 ... 47
• 가. 제 1세부과제 : 유용 재조합단백질 생산 시스템 개발 ... 47
• 나. 제 2세부과제 : 버섯 유용재조합 단백질 발현 시스템개발 (협동연구기관 : (주)캐러스) ... 50
• 다. 제 3세부과제 : 버섯 유용 재조합 단백질 자실체 및 균사체 대량 배양 시스템 개발(협동연구기관 : 전북대학교) ... 52
• 2. 연구개발의 추진체계 ... 54
• 3절 연구개발결과 ... 55
• 1. 제 1세부 과제 : 유용 재조합단백질 생산 시스템 개발 (조선대학교) ... 55
• 가. 성장 호르몬 (Growth Hormone) ... 55
• 나. 인터루킨32(Interleukin 32, IL-32) ... 71
• (1) Beta-glucuronidase(GUS) assay ... 71
• (2) 암 배양과 hygromycine(50 ㎍/ml) 함유 배지에서 수율 ... 73
• (3) 형질전환 균사체 Genomic DNA 분리 ... 75
• (4) 형질전환 균사체 확인 : Southern blot ... 77
• (5) SDS PAGE ... 79
• (6) 형질전환 균사체 protein level 발현확인 : Western blot ... 81
• (7) biological activity of IL-32 ... 82
• (가) MIP-2 ... 82
• (나) TNF-alpha ... 82
• 다. hPDGF-BB ... 85
• (1) PCR ... 85
• (2) Sequencing ... 87
• (3) Agrobacterium 형질전환 PCR ... 89
• (4) 버섯 균사체 오염률과 발생률 ... 91
• (5) GUS 활성의 조직화학적 분석 ... 93
• (6) 형질전환 균사체의 유전자 도입 확인 ... 95
• (7) Total RNA 분리 및 cDNA 합성과 유전자 도입 확인 ... 97
• (8) 형질전환 균사체의 단백질 분리 및 분석 ... 99
• (가) 단백질 정량 ... 99
• (나) Western blot analysis ... 100
• (9) Fusion Protein Purification 및 분석 ... 102
• (10) MALDI-TOF mass spectrometry를 이용한 재조합 단백질의 질량분석 ... 105
• (11) 재조합 단백질의 Bioactivity assay ... 107
• (12) 형질전환 균사체에서 생산된 자실체의 분석 ... 109
• (가) PCR analysis ... 110
• (나) Southern bolt analysis ... 111
• (다) Total RNA analysis ... 113
• (라) Western blot analysis ... 114
• 라. Secretion signal (a-factor) ... 115
• 2. 제 1협동과제 : 버섯 유용재조합 단백질 발현 시스템 개발((주)캐러스) ... 133
• (1) 버섯 특이적 프로모터 Tag 및 형질전환체 선별 ... 133
• (2) 형질전환 버섯 게놈 DNA 추출 ... 134
• (3) TAIL PCR of promoter tag ... 134
• (4) TAIL PCR 개요 ... 136
• (5) TAIL PCR 장점 ... 136
• (6) TAIL PCR 중요한 특성 및 방법 ... 136
• (7) 특이 프로모터 단편 클로닝 ... 139
• (8) DNA 염기서열 분석 ... 139
• (9) 결과 ... 139
• (가) 버섯 promoter trap vector 제작 ... 139
• (나) Promoter trap 형질전환체 선별 ... 140
• (다) Strategies for isolating and cloning sequences flanking T-DNA (Figure 3) ... 141
• (라) Analysis of 5'-end cloning sequences flanking T-DNA ... 144
• (10) α-factor vector construction ... 144
• 3. 제 2협동과제 : 버섯 유용 재조합 단백질 자실체 및 균사체 대량 배양 시스템 개발 (전북대학교) ... 149
• 가. 주요 연구내용 및 결과요약 ... 149
• (1) 서론 ... 149
• (2) 연구내용(재료 및 방법) ... 150
• (가) 공시 균주 ... 150
• (나) 액체 배지의 조제 ... 151
• (다) 고체 배지의 조제 ... 157
• (라) Chitin 함량분석 ... 157
• (마) Ergosterol 함량분석 ... 157
• (3) 결과 및 고찰 ... 158
• (가) 균사체 생산 최적배지 조성 ... 158
• (나) 곡물배지의 Chitin과 Ergosterol 정량에 의한 균체량 측정 ... 160
• (다) 균사체 및 자실체 건조 회수량 ... 162
• (라) 형질전환 버섯균의 균사체 및 자실체 대량생산 시스템 구축 ... 164
• (4) 요약 ... 170
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 172
• 1절 연구개발목표의 달성도 및 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 172
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 176
• 1절 연구개발 성과 ... 176
• 1. 학술발표 : 한국버섯학회 포스터 발표 ... 176
• 2. 수상 : 한국버섯학회 포스터 발표 우수상 수상 ... 178
• 3. 학술발표 : 일본분자생물학회 포스터 발표 ... 179
• 4. 특허출원 ... 181
• 5. 학위논문 ... 190
• 6. 연구개발결과의 성과 및 활용목표 대비 실적 ... 194
• (1) 연구성과 목표 ... 194
• (2) 연구성과 활용 ... 194
• (3) 논문게재 성과 ... 195
• (4) 특허 성과 ... 199
• (5) 인력활용/양성 성과 ... 199
• (6) 경제사회 파급효과 ... 199
• 7. 구매금액이 3천만원 이상 기자재 구매현황 ... 199
• 8. 연구비 집행실적 ... 200
• 9. 중요 연구변경 사항 ... 200
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 201
• 1절 국내외 관련분야 환경변화 ... 201
• 제7장 참고문헌 ... 203
• 끝페이지 ... 210