초록 ▼

〇 연구개발 목표 및 내용
목표 : 국내 발병이 확인된 꿀벌 주요 질병에 대한 총체적 진단시스템을 확립
내용 1) 꿀벌 주요 질병에 대하여 각 특이 병인체의 신속검색을 위한 실시간 정량 PCR법을 신규 또는 개선 개발함. 2) 꿀벌 주요 질병의 병인체에 대하여, 재조합 DNA방법 등에 의하여 각 특이 항원단백질을 생산하고, 이어 하이브리도마법을 이용한 특이항체를 생산하고자 함. 3) 특이 항체를 이용 ELISA법에 의한 면역학적 진단법 및 양봉 현장에서 꿀벌 질병을 쉽게 검색해 낼 수 있는 래피드 키트를 개발함. 4) 질

〇 연구개발 목표 및 내용
목표 : 국내 발병이 확인된 꿀벌 주요 질병에 대한 총체적 진단시스템을 확립
내용 1) 꿀벌 주요 질병에 대하여 각 특이 병인체의 신속검색을 위한 실시간 정량 PCR법을 신규 또는 개선 개발함. 2) 꿀벌 주요 질병의 병인체에 대하여, 재조합 DNA방법 등에 의하여 각 특이 항원단백질을 생산하고, 이어 하이브리도마법을 이용한 특이항체를 생산하고자 함. 3) 특이 항체를 이용 ELISA법에 의한 면역학적 진단법 및 양봉 현장에서 꿀벌 질병을 쉽게 검색해 낼 수 있는 래피드 키트를 개발함. 4) 질병시료로 부터 병인체 확인에 의한 진단을 목표로, 대량의 검체를 동시에 처리할 수 있는 일괄 표준 실험법을 확립함. 5) 유효 약제, 예방 요령 등을 제시한 표준 처방법을 신규 제정하여, 진단결과와 함께 표준 처방 지침을 통보할 수 있도록 하는 것을 목표로 한다.
〇 연구결과
국내 발병이 확인된 15종의 꿀벌 주요 질병에 대한 총체적 진단시스템을 확립하였음. 해당되는 질병은미국부저병 (AFB), 유럽부저병 (EFB), 백묵병 (Chalkbrood), 노제마병 (Nosema Disease)의 2종, 낭충봉아부패병(Sacbrood) 및 최근 국내의 토종벌을 거의 괴멸수준으로 피해를 입힌 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 (Korean Sacbrood Virus; kSBV), 만성마비병 (Chronic bee paralysis virus), Black queen cell virus, 날개불구병 (Deformed wing virus) 및 Israel acute paralysis virus 그리고 본 연구를 통하여 국내 발병이 확인된 Kakugo virus 등이다. 이들 모두에 대하여 최소 1가지 이상의 진단법을 확립하였으며，이중 신규 개발된 진단법은, 초고속 PCR법이 8종, PCR법이 9종, LAMP법이 8종, Rapid kit가 4종이었다. 또한 꿀벌의 질병시료(애벌레 및 성충)으로부터 DNA 및 RNA의 genome을 갖는 병원체를 일괄적으로 쉽게 분리하고 유전자검사 및 항원검사를 수행할 수 있는 일괄 진단실험법을 제정하였으며, 진단결과에 따라 유효 약제를 추천할 수 있는 표준 처방을 또한 제시하였다.
〇 연구성과 활용실적 및 계획
본 연구의 성과물은 DNA 및 RNA genome을 갖는 병원체들에 대한 유전자 검사의 kit로써, 우선, LAMP키트들은 (주)GeneClone과 협의를 마쳐 7종의 시제품을 생산하였으며, 다른 병원체에 대한 LAMP kit들과 초고속 PCR kit 및 일반 PCR kit들도 그 상품화를 협의 중에 있다. 한편, 특이 항체를 사용하는 면역학적 키트(Rapid kit)들은 4종의 주요 질병에 대하여 현재 (주)Bionote와 제품화 실험을 진행 중이며, 다른 병원체에 대한 Rapid kit들도 그 상품화를 협의 하고 있다. 아올러，꿀벌의 질병시료로부터 보다 쉽게 DNA 및 RNA genome을 분리하기 위한 꿀벌질병시료 전문 핵산 분리 kit도 (주)BioSolution과 협의 중에 있다.

(출처 : 연구개발 보고서 초록 295p)

Abstract ▼

IV. Results and their applications
From the various kinds of developments to detect honeybee-pathogens, total 19 detection methods were newly developed against total 10 different pathogens.

1. New detection method by LAMP for Paenibacillus larvae (AFB)
2. New immunological method to det

IV. Results and their applications
From the various kinds of developments to detect honeybee-pathogens, total 19 detection methods were newly developed against total 10 different pathogens.

1. New detection method by LAMP for Paenibacillus larvae (AFB)
2. New immunological method to detect Paenibacillus larvae (AFB)
3. New detection method by LAMP for Melissococcus plutonius (EFB)
4 New immunological method to detect Melissococcus plutonius (EFB)
5. New detection method by LAMP for Nosema cerana
6. New detection method by Ultra-Rapid PCR for Nosema cerana
7. Development of new detection method by LAMP for Ascosphaera apis (CB)
8. Development of new LAMP detection for Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV)
9. New Ultra-rapid PCR to detect Black queen cell virus (BQCV)
10. New immunological method to detect Black queen cell virus (BQCV)
11. New detection method by Ultra-Rapid PCR for Deformed Wing Virus (DWV)
12. New Ultra-rapid PCR to detect Sac Brood Virus (SBV)
13. New detection method by LAMP for Sac Brood Virus (SBV)
14. New PCR detection method to distinguish kSBV from SBV
15. New immunological method to detect Sac Brood Virus (SBV)
16. New Ultra-rapid PCR to detect Israelii acute paralysis viruses (IAPV)
17. New detection method by RT-LAMP for Israelii acute paralysis viruses(IAPV)
18. New immunological method to detect Israelii acute paralysis viruses (IAPV)
19. New detection method by RT-LAMP for Kakugo virus (KV)

For the purpose of molecular diagnostic system against honeybee diseases, total 24 detection methods were improved and applied. With newly developed and improved methods, the molecular diagnostic system against honeybee diseases was basically established By this system, 15 different species of bee-pathogens could be detected. They are all pathogens that still are identified in Korea.
15 species of bee-pathogens are Paenibacillus larvae (AFB； American Foul Brood), Melissococcus plutonius (EFB； European Foul Brood), Ascosphaera apis (CB； Chalk Brood), Aspergillus fulavus (SB； Stone Brood), Nosema apis (Nosema disease), Nosema cerana (Nosema disease), Acute Bee paralysis virus (ABPV), Black Queen Cell Virus (BQCV), Chronic bee paralysis virus (CBPV), Deformed Wing virus (DWV), Israel acute paralysis Virus (IAPV), Kashmir Bee Virus (KBV), Kakugo Virus (KV), Sacbrood virus (SBV), and korean Sac Brood Virus (kSBV).

All 15 pathogens could be detected by PCR or Real-Time PCR in laboratory, however, only 8 species could be tested by Ultra-Rapid PCR including Paenibacillus larvae (AFB), Melissococcus plutonius Ascosphaera apis (CB)，Nosema cerana, Black Queen Cell Virus (BQCV), Deformed Wing virus (DWV), Israel acute paralysis Virus (IAPV), Sacbrood virus (SBV).

For the easy field test, 8 major honeybee pathogens could be recognized by LAMP method, such as Paenibacillus larvae (AFB), Melissococcus plutorxius (EFB), Ascosphaera apis (CB)，Nosema cerana，Chronic bee paralysis virus (CBPV), Israel acute paralysis Virus (IAPV), Sacbrood virus (SBV), Kakugo Virus (KV) without special equipments such as PCR thermocycler. In addition, Paenibacillus larvae (AFB), Melissococcus plutortius (EFB), Black Queen Cell Virus (BQCV), Deformed Wing virus (DWV), Chronic bee paralysis virus (CBPV), Israel acute paralysis Virus (IAPV), Sacbrood virus (SBV) could be tested by Immunochromatographic Rapid kit.

Diagnosis aganst honeybee diseases begin receiving of samples (egg, larvae, adult bee, or honey). Molecular diagnosis is a system of procedures including preparations of sample, molecular detections in laboratory or in field, and even standard treatments.

(출처 : SUMMARY 8p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 11
• 목차 ... 14
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 20
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 21
• 제3장 연구개발수행 내용 몇 결과 ... 23
• 제1절 미국부저병 검색을 위한 신규 검출법의 개발 ... 23
• 1. 미국부저병의 원인균 Paenibacillus larvae에 대한 LAMP 신규검출법의 개발 ... 23
• 2. 미국부저병의 원인균 Paenibacillus larvae에 대한 면역학적 신규검출법의 개발 ... 27
• 제2절 유럽부저병 검색을 위한 신규 검출법의 개발 ... 46
• 1. 유럽부저병의 원인균 Melisococcus plutonius에 대한 LAMP 신규검출법의 개발 ... 46
• 2. 유럽부저병의 원인균 Melisococcus plutonius에 대한 면역학적 신규검출법의 개발 ... 49
• 제3절 노제마병 검색을 위한 신규 검출법의 개발 ... 62
• 1. Nosema병의 원인균 Nosema cerana에 대한 LAMP 신규검출법의 개발 ... 62
• 2. Nosema병의 원인균 Nosema cerana에 대한 초고속 PCR 신규검출법의 개발 ... 72
• 제4절 백묵병 검색을 위한 LAMP 신규 검출법의 개발 ... 76
• 1. LAMP법을 이용한 백묵병 원인균 Ascosphera apis의 검출법 개발 ... 76
• 제5절 CBPV 검색을 위한 LAMP 신규 검출법의 개발 ... 90
• 1. LAMP법을 이용한 Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV)의 신속 진단법 개발 ... 90
• 제6절 BQCV 검색을 위한 신규 검출법의 개발 ... 97
• 1. 초고속 PCR법을 이용한 Black Queen Cell Virus (BQCV) 신속 진단법 개발 ... 97
• 2. 재조합 단백질의 발현을 통한 Black Queen Cell Virus 특이 항원의 생산 ... 100
• 3. ITC법에 의한 재조합 Black Queen Cell Virus 특이 항원의 정제 ... 110
• 제7절 DWV 검색을 위한 초고속 PCR 검출법의 개발 ... 115
• 1. 초고속 PCR법을 이용한 DWV (Deformed Wing Virus) 신속 진단법 개발 ... 115
• 제8절 SBV와 kSBV 검색을 위한 신규 검출법의 개발 ... 120
• 1. 초고속 PCR법을 이용한 SBV (Sacbrood Virus) 신속 진단법 개발 ... 120
• 2. LAMP법을 이용한 Sacbrood Virus (SBV)의 검출법 개발 ... 125
• 3. Sacbrood Virus와 Korean Sacbrood Virus의 구별 검출을 위한 PCR법 개발 ... 135
• 4. Sacbrood Virus의 특이 항원 생산을 재조합 SBV Capsid protein의 발현 및 정제 ... 144
• 5. 특이 단일클론항체를 이용한 Sacbrood Virus의 검출 ... 147
• 제9절 IAPV 검색을 위한 신규 검출법의 개발 ... 151
• 1. 초고속 PCR법을 이용한 IAPV (Israel acute paralysis Virus) 신속 진단법 개발 ... 151
• 2. RT-LAMP법을 이용한 IAPV (Israel acute paralysis Virus) 신속 진단법 개발 ... 159
• 3. RNA-dependent RNA Polymerase(RdRP) 서열에 따른 IAPV 계통분류학적 고찰 ... 165
• 4. Israel acute paralysis virus (IAPV)의 항원을 위한 재조합 Capsid protein의 생산 ... 179
• 제10절 Kakugo virus의 검색과 신규 검출법의 개발 ... 184
• 1. Kakugo virus의 국내 존재의 규명 ... 184
• 2. Loop-mediated isothermal Amplification(LAMP) 법을 이용한 Kakugo Virus의 새로운 검출법 개발 ... 187
• 제11절 꿀벌 질병의 원인체에 대한 배양법 확립 ... 198
• 1. 미국부저병의 원인균인 Paenibacillus larvae의 배양법 ... 198
• 2. 유럽부저병의 원인균인 Melissococcus plutonious의 배양법 ... 200
• 3. 백묵병의 원인균인 Ascosphaera apis 의 배양법 ... 202
• 4. 노제마병의 원인균인 Nosema apis 의 배양법 ... 203
• 5. 꿀벌 바이러스들의 배양 ... 204
• 제12절 꿀벌 질병시료에 대한 다중 병원체 검사체계 ... 206
• 1. 시료의 접수 및 광학현미경 검사 ... 206
• 가. 시료의 접수 ... 206
• 나. 외형 관찰에 의한 예비 진단 ... 206
• 다. 해부 검사에 의한 시료 채취 및 1차 진단 ... 206
• 라. 광학 현미경 검사 ... 207
• 2. 특이 유전자에 의한 꿀벌병원체의 검색 ... 208
• 가. 유전자 검사의 개요 및 종류 ... 208
• 나. DNA 및 RNA의 순수분리 ... 208
• 다. Reverse transcriptase reaction ... 211
• 라. 일반PCR을 사용하는 꿀벌질병의 detection ... 211
• 마. 정량 PCR을 사용하는 꿀벌질병의 detection ... 213
• 바. 초고속 PCR을 사용하는 꿀벌질병의 detection ... 216
• 사. PCR detection용 primer쌍 (일반 PCR용, 정량 및 초고속 PCR용) ... 217
• 아. LAMP법을 사용하는 꿀벌질병의 detection ... 223
• 자. LAMP detection용 primer들 ... 225
• 3. 특이 항체에 의한 꿀벌병원체의 검색 ... 232
• 가. Immunochromatography법에 의한 검사 ... 232
• 나. Immunochromatography법에 의해 검사가 가능한 병원체의 종들 ... 234
• 제13절 꿀벌 질병의 진단에 따른 표준 처방 ... 236
• 1. 꿀벌의 감염성 질병 치료를 위한 꿀벌응애 구축법들 ... 236
• 가. 개요 ... 236
• 나. 꿀벌응애의 구축을 위한 친환경 생물학적 처치법 ... 237
• 다. 꿀벌응애의 구축을 위한 약품들 ... 240
• 2. 미국부저병(AFB), 유럽부저병(EFB)에 대한 항생제의 처치 ... 241
• 가. 테트라사이클린에 의한 세균성 질병의 처치 ... 241
• 나. 네오테트라에 의한 세균성 질병의 처치 ... 242
• 다. 소각 처리 ... 243
• 3. 노제마병에 대한 처치 ... 243
• 가. Fumagillin(퓨마질린)에 의한 노제마병에 대한 처치 ... 243
• 나. 그 외의 노제마 제어 약품들 ... 244
• 4. 백묵병(CB), 석고병(SB) 등 병원성 진균에 대한 처치 ... 245
• 가. 사양관리에 강화에 의한 진균성 질병의 극복 ... 245
• 나. 그 외의 진균성 질병에 대한 약품들 ... 245
• 5. 꿀벌의 병원성 바이러스에 대한 처치 ... 247
• 가. 사양관리에 강화에 의한 꿀벌 바이러스성 질병의 극복 ... 247
• 나. 꿀벌응애의 구축에 의한 바이러스성 질병의 극복 ... 247
• 다. 그 외의 바이러스성 질병에 대한 소독제들 ... 248
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 250
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 253
• 제1절 연구성과물들의 개요 ... 253
• 제2절 본 연구에 의하여 발표된 학술논문들 ... 254
• 제3절 꿀벌 질병 진단을 위한 LAMP 키트 들 ... 257
• 제4절 꿀벌 질병 진단을 위한 Immunochromatography 키트들 ... 271
• 제5절 꿀벌 질병시료에 대한 다중 검사체계 및 표준 처방 ... 277
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 278
• 제7장 연구시설·장비 현황 ... 279
• 제8장 참고문헌 ... 280
• 별첨1 연구개발보고서 초록 ... 295
• 끝페이지 ... 294