초록 ▼

연구의 목적 및 내용

○ 본 연구의 목표는 생체 시료에서 신경계 질환의 진단을 위한 biogenic amine의 효과적인 프로화일링 분석법 개발로써 dopamine, serotonin, GABA와 같은 주요 신경전달물질의 전구체 아미노산인 tyrosine, tryptophan, glutamate로부터 대사되는 대사경로 전반에 걸쳐있는 생체아민을 통합적으로 프로화일링하고자 하였다. 각 연구차년도 별로 GC-MS/MS 기반의 분석법을 바탕으로 분석대상성분의 점진적인 증가를 목표로 하였다. 이에 따라 분석법은 최초 10종에서

연구의 목적 및 내용

○ 본 연구의 목표는 생체 시료에서 신경계 질환의 진단을 위한 biogenic amine의 효과적인 프로화일링 분석법 개발로써 dopamine, serotonin, GABA와 같은 주요 신경전달물질의 전구체 아미노산인 tyrosine, tryptophan, glutamate로부터 대사되는 대사경로 전반에 걸쳐있는 생체아민을 통합적으로 프로화일링하고자 하였다. 각 연구차년도 별로 GC-MS/MS 기반의 분석법을 바탕으로 분석대상성분의 점진적인 증가를 목표로 하였다. 이에 따라 분석법은 최초 10종에서 20종의 대사체 성분으로 확대되었으며 추가적으로 생체시료 분석에 대한 적합성 및 실제 진단법 적용에 대한 임상적 적용성을 염두에 두고 LC-MS/MS에 대한 분석법 개발을 추가적으로 시도하게 되었다. 결과적으로 tyrosine, tryptophan, glutamate 대사경로를 기반으로 생체아민 20개의 성분을 동시에 분석할 수 있는 GC-MS/MS와 LC-MS/MS 분석플랫폼이 개발되었다.

연구결과

○ 연구 도입 시기에는 dopamine을 비롯한 10개의 생체아민을 기반으로 GC-MS/MS 분석플랫폼을 개발하기 위하여 유도체화 조건 등의 최적화를 수행하였으며 이를 기반으로 20개의 생체아민과 그 대사체에 대한 프로화일링으로 확장하였다. 생체시료는 소변시료를 기반으로 mixed-cation exchange (MCX) 유형의 고체상추출법 (solid-phase extraction, SPE) 카트리지를 이용하여 정제 및 추출을 수행하였다. 추출된 생체아민들은 극성의 관능기에 대한 휘발도를 높이기 위하여 N-methyl-N-hexamethyldisilazane(HMDS)와 N-methyl-bis(heptafluorobutyramide) (MBHFBA)의 유도체화 시약을 이용하여 2단계의 유도체화 과정을 거쳤으며 그 결과 carboxylic acid기와 amine기, phenol기와 alcohol기에 대해 온전하게 유도체화를 수행할 수 있었다. 개발된 분석법은 직선성, 검출한계와 정량한계, 정밀성과 정확도, 매트릭스 영향에 대한 조사를 통해 분석법 타당성 검증을 수행하였다. 그 결과 검량선에 대한 직선성 상관계수(correlation coefficients) R2 값이 0.996 이상으로 나타났으며 검출한계는 0.02 –11.10 ng/mL, 정량한계는 1 –25 ng/mL로 조사되었다. 정밀도와 정확도는 일내 5회 반복과 서로 다른 5일 간 반복실험을 수행하여 결과를 얻었으며 각각 0.2 –10.7%와 87.5 –112.6%로 나타났다. 내인성의 분석방해요인에 대한 매트릭스 영향을 조사하기 위하여 생체시료에 표준품을 첨가하여 표준품과 얻어진 피크의 면적값을 비교한 결과 82 –117% 사이로 양호하게 나타났다. 따라서 본 분석법은 내인성 물질에 의한 매트릭스의 영향 없이 높은 정밀도와 정확도를 가진 분석법으로 확인되었다. 수립된 분석법은 생체시료에 적용성을 확인하였으며 연구결과를 체계적으로 정리하여 Journal of Chromatography B에 2017년 게재 하였다. (참고: J. Chromatogr. B 1051 (2017) 97-107)
○ 실제 임상 적용성과 생체 시료에 대한 적합성 등을 고려하여 추가적으로 LC-MS/MS 기반의 분석플랫폼을 개발하고자 하였다. 이에 따라 20개로 확장된 생체아민과 그 대사체들에 대한 프로화일링 방법을 개발하였다. 상이한 극성의 생체아민과 그 대사체 20종 성분에 대해서 carboxylic acid기에 대한 선택적인 ester 유도체화 반응을 도입하였다. 이를 통해 2차 대사체인 glucuronide와 sulfate 포합체를 떨어뜨리기 위한 가수분해반응과 단백질 침전반응을 유도체화 반응과 동시에 수행할 수 있었다. 또한, 산성의 대사체와 양쪽성을 띄는 zwitterion 형태의 대사체들을 중성 혹은 염기성으로 전환시켜 positive ion mode에서 동시에 검출가능하였다. 유도체화 과정에서 발생한 다량의 염들은 제염과정을 통해 이온화 과정에서의 이온억제현상 유발을 제거하였고 ESI-MS/MS-MRM법을 적용하여 동시에 검출을 수행하였다. (J. Chromatogr. 2017, in submission)

연구결과의 활용계획

○ 본 연구에서 개발된 GC-MS/MS와 LC-MS/MS 분석플랫폼은 tyrosine, tryptophan, glutamate의 대사경로를 기반으로 20개의 생체아민과 그 대사체를 생체시료에서 검출할 수 있는 분석기법이다. 이를 통해 소변과 같은 생체시료에서 각 질환과 관련한 프로화일의 변화를 추적하여 체내 신경망과 질환에 대한 기전을 이해하고 질환의 조기진단을 위한 지표물질 (biomarker)을 발굴해낼 수 있을 것으로 기대된다.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose & contents

The purpose of the current research is to develop the profiling analysis of bioamines for the early diagnosis of neuronal diseases, cardiovascular disease and cancer in biological fluids with high sensitivity and selectivity with optimizing an efficient cleanup method. The

Purpose & contents

The purpose of the current research is to develop the profiling analysis of bioamines for the early diagnosis of neuronal diseases, cardiovascular disease and cancer in biological fluids with high sensitivity and selectivity with optimizing an efficient cleanup method. The profiling analysis will be combined with statistical analysis to find biomarkers according to diseases caused by dysbolism of body system. The developed method will be applied to control and patients groups for early diagnosis of disease

Result

< The 1st year : Development of the profiling analysis of bioamines for the early diagnosis of neuronal diseases, cardiovascular disease and cancer in biological fluid >
- Development of the profiling analysis of 20 bioamines and their metabolites
- Application of the analytical method for clinical urine samples to find biomarkers according to specific neuronal diseases
ㆍAnalysis of profiling data obtained from patients and controls' urine samples according to diseases
- Development of the profiling analysis for early diagnosis of several neuronal diseases, tumors and cardiovascular diseases
ㆍDevelopment of statistical analysis of chemical fingerprinting
- Discovery of biomarkers using Principal Component Analysis (PCA)
- Discovery of biomarkers using Hierachical Cluster Analysis (HCA)
ㆍResearch of the enzyme involved metabolic disorder for biomarkers
ㆍAnalytical method using GC-MS/MS-MRM
< The 2nd year : Development of the profiling analysis of kynurenine and their metabolites in human urine >
< The 3rd year : Development of the profiling analysis of polyamines in human urine >
ㆍOptimization of hydrolysis condition for bioamines and their metabolites which combined with glucuronic acid or sulphate
ㆍDevelopment of efficient pretreatment methods about extraction and cleanup
ㆍDevelopment of high sensitive and selective derivatization method
ㆍDevelopment of high selective detection method using GC-MS/MS-multiplen reaction monitoring (MRM)

Expected Contribution

ㆍDiscovery of biomarkers for early diagnosis of several diseases by simultaneous trace analysis of bioamines and profile changes
ㆍApplication to find metabolic disorders of biomarkers and investigate human metabolism according to diseases
ㆍImprovement of the detection technology for trace levels(ppb or sub-ppt) of endogenous compounds in complex biological tissues
ㆍInvestigation of the role of enzyme involved metabolic disorders

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 6
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 7
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 8
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 10
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 10
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 11
• 8. 참고문헌 ... 11
• 9. 연구성과 ... 13
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 18
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 18
• 12. 기타사항 ... 18
• 별첨1 대 표 연 구 실 적 ... 19
• 별첨2 세부 목표 관련 증빙 ... 34
• 끝페이지 ... 51