초록 ▼

연구의 목적 및 내용
Exenatide는 2.4시간이라는 짧은 반감기로 인해 하루 2회씩 투여해야 하는 단점이 있다. 현재, 국내외의 많은 연구진은 exenatide의 반감기 향상을 위해 PEGylation, Fc, HSA attachment 등 다양한 연구를 진행하고 있다. 본 연구에서는 생체적합성을 지닌 비활성 폴리펩타이드인 Elastin-based polypeptides (EBP)를 이용한 펩타이드/단백질의 genetic modification 공정을 E. coli 와 yeast 두 종류의 microbial system에

연구의 목적 및 내용
Exenatide는 2.4시간이라는 짧은 반감기로 인해 하루 2회씩 투여해야 하는 단점이 있다. 현재, 국내외의 많은 연구진은 exenatide의 반감기 향상을 위해 PEGylation, Fc, HSA attachment 등 다양한 연구를 진행하고 있다. 본 연구에서는 생체적합성을 지닌 비활성 폴리펩타이드인 Elastin-based polypeptides (EBP)를 이용한 펩타이드/단백질의 genetic modification 공정을 E. coli 와 yeast 두 종류의 microbial system에서 각각 구축하여 보다 효율적이고 경제적인 공정을 선택하고자 한다. 이를 통해 혈액내 안정성이 향상되고 면역유발성이 저하된 의약용 단백질을 창출하여 서방형(sustained release) 약물로 응용한다. 또한 EBPylation된 융합단백질의 말단에 지방산과 같은 소수성 물질을 bioconjugation을 통해 접합시켜 양친성(amphiphilic) 단백질을 합성하여 생물인식(biorecognition)용 도메인으로 이용하여 표적전달에 응용 연구한다.

연구결과
1. 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (EBP) 발현용 유전자 라이브러리 구축
- PEGylation 경우를 참조해 목적단백질(exendin-4: 4,200 Da)에 융합 도메인의 크기는 4,000-8,000 Da 이 최적으로 판단되어 (EBP)₁₀ 과 (EBPFF)₁₀ 유전자 구축 완료
- 분자 구조 및 분자량, hydrophobicity index, 생체적합성 분석을 통한 최적 EBP 발굴(유전자의 GC content 를 감소시키고 stem loop 등 특이구조를 피하고 소수성을 최소화시키기 위한 EBP 유전자 최적화 완료)
2. EBPylation 공정을 통한 고기능성 융합단백질 창출 및 특성분석
- exenatide의 C-term에 10개의 EBP (VPGVG) 서열이 오도록 유전자 합성(이하 Ex-EBP₁₀).
- E. coli 경우, 발현율을 향상시켜 줄 maltose binding protein(MBP) tag을 부착한 뒤 pET23a(+)에 cloning하여 BL21(DE3)pLysS에 transformation.
- yeast의 경우, Ex-EBP₁₀이 발현 시 broth로 분비될 수 있도록 pGal vector에 MFα prepro signal peptide를 삽입하여 cloning한 후 Y2805 균주에 transformation.
- 창출된 융합단백질들의 이화학적 성질 및 생물학적 활성, 안정성, 면역성 등 in vitro 분석.
3. Bioconjugation 을 이용한 양친성(amphiphilic) 융합단백질 합성 및 특성화
- 협력연구(한양대학교 캡스톤디자인 연구팀)를 통해 리포좀 전달체를 제작하고 이의인지질 이중막 내부에 소수성이 높은 올레익산(oleic acid)을 내포시킨 시스템은 구축 완료하였으나 정제된 융합단백질을 수득하지 못해 bioconjugation은 아직 달성하지 못했음

연구결과의 활용계획
- 본 융합단백질은 낮은 분자량으로 인한 신장 배출, 체내 단백질 분해효소들에 의한 분해, 체내 면역반응 유발 등의 문제점들을 극복하여 궁극적으로 제 2 형 당뇨병 환자들에 대한 exenatide 주사 빈도를 감소시킬 바이오베터 치료제로 활용될 것으로 예상.
- 추후 EBP의 길이에 따른 반감기 향상 효과를 비교해보고 최적의 EBP 길이를 결정하는 연구를 계획하고 있음. 각 EBP 의 분자량과 비슷한 PEG 로 PEGylation 시킨 exenatide 와 stability, 면역원성 등을 비교해 보고자 함.
- EBPylation 공정을 하나의 플랫폼으로 만들어 다른 펩타이드/단백질에 적용시켜 융합된 펩타이드/단백질의 stability, 면역원성 등을 향상시키는 연구를 계획 중임.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose& contents
The objectives are to develop recombinant microbial (E. coli and yeast) expression systems for a fusion protein of a peptide (exenatide) and inactive polypeptide (elastin based polypeptide: EBP). The resulting fusion protein would possess superior in-serum stability and reduced

Purpose& contents
The objectives are to develop recombinant microbial (E. coli and yeast) expression systems for a fusion protein of a peptide (exenatide) and inactive polypeptide (elastin based polypeptide: EBP). The resulting fusion protein would possess superior in-serum stability and reduced immunogenicity, which can be used as a biobetter for sustained release application. Furthermore, a hydrophobic domain can be attached to the fusion protein terminus that can be used as a biorecognition domain for targeted delivery application.

Result
1. Establishing gene library for EBP expression
- Considering optimal length of EBP domain would be 4,000-8,000 Da for the target protein (exendin-4: 4,200 Da), gene library for (EBP)₁₀ and (EBPFF)₁₀ was established.
- Codon optimization was completed considering molecular structure and weight, hydrophobicity index, GC content, peculiar structures such as stem loop, and minimal hydrophobicity.
2. Expression of EBPylated fusion protein and its characterization
- Gene synthesis for Ex-EBP₁₀ by adding 10 repeats of EBP (VPGVG) to the C-terminus of exenatide.
- For E. coli expression, maltose binding protein(MBP) tag was attached to the N-terminus for ehhanced expression, cloned to pET23a( ), and transformed into BL21(DE3)pLysS strain.
- For yeast (Saccharomyces serevisiae) expression, MFαprepro signal peptide was inserted into pGal vector for secretory expression,
- 창출된 융합단백질들의 이화학적 성질 및 생물학적 활성, 안정성, 면역성 등 in vitro 분석.
3. Synthesis of amphiphilic fusion protein and bioconjugation into liposome
- Completed liposome preparation and insertion of hydrophobic oleic acid into phospholipid bilayer
- Bioconjugation with the purified fusion protein is still ongoing

Expected Contribution
- The fusion protein can be a biobetter with reduced injection frequency for Type 2 diabetes
- The effects of EBP length on half-life extension and immunogenicity are studied and will be compared with those of the PEGylated ones
- EBPylation process can be a platform process that can be used to improve stability and reduce immunogenicity of other therapeutic proteins

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 8
• 3.1. gene codon optimization ... 8
• 3.2. primer design ... 9
• 3.3. Gene Cloning 및 확인 ... 10
• 3.4. Transformation 및 발현 확인 (Ex-(EBP)10) ... 11
• 3.5. 융합단백질(MBP-Ex-(EBP)10과 secretion용 Ex-(EBP)10) 발현 vector cloning 및 transformation ... 13
• 3.6. 융합단백질 발현 및 정제 (E. coli 및 S. cerevisiae 시스템) ... 13
• 3.7. EBPylation과의 성능 비교를 위한 PEGylation ... 16
• 3.8. 생물학적 활성 시험 ... 17
• 3.9. 혈장내 in vitro 안정성 시험 ... 18
• 3.10. In vivo 실험 ... 18
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 20
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 22
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 22
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 23
• 8. 참고문헌 ... 24
• 9. 연구성과 ... 24
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 25
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 25
• 12. 기타사항 ... 25
• 별첨1 : 대표연구실적 ... 26
• 별첨2 : 세부 목표 관련 증빙 ... 34
• 끝페이지 ... 39