초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구과제는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 하는 게놈에디팅 기술을 활용하고, 이를 바이오에너지 생산 균주에 적용하여 효율적인 균주개량에 응용하는 것을 목표로 함. CRISPR Cas9을 작동시키기 위한 플라스미드와 프로토콜을 구축하고, 상동재조합과 빗상동말단접합을 활용한 게놈 수준의 목적진화 방법을 구현하고자 함. 이는 타이로신 생산균주에 적용되어 효율적인 목적진화를 확인하고자 하며 최근 각광받고 있는 바이오부탄올 생산균주 개발에 적용하여 높은 효율을 지닌 안정적인 바이오 에너지 생산균주를 제

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구과제는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 하는 게놈에디팅 기술을 활용하고, 이를 바이오에너지 생산 균주에 적용하여 효율적인 균주개량에 응용하는 것을 목표로 함. CRISPR Cas9을 작동시키기 위한 플라스미드와 프로토콜을 구축하고, 상동재조합과 빗상동말단접합을 활용한 게놈 수준의 목적진화 방법을 구현하고자 함. 이는 타이로신 생산균주에 적용되어 효율적인 목적진화를 확인하고자 하며 최근 각광받고 있는 바이오부탄올 생산균주 개발에 적용하여 높은 효율을 지닌 안정적인 바이오 에너지 생산균주를 제작하고자 함.

□ 연구결과
본 연구에서는 CRISPR/Cas 시스템을 효율적으로 적용하기 위한 플라스미드를 구축하였으며, 이를 활용하여 E. coli, E. aerogenes를 포함한 다양한 균주에서 해당시스템이 작동하는 것을 확인함. crRNA와 tracrRNA가 포함된 pZS CRISPR 플라스미드와 cas9이 포함된 pCas9을 이용하여 CRISPR/Cas 시스템을 구동함. 또한 게놈편집 후 추가 게놈편집의 용이성을 위해 Bacillus subtilis 유래의 sacB를 클로닝하여 sucrose 환경에서 플라스미드의 제거를 용이하게 함. 이를 활용하여 유전자의 제거 및 삽입, point mutation을 도입 한 결과를 얻음. 또한 nuclease activity가 비활성화 된 dCas9 기술과 리보스위치를 통한 N-acetylglucosamine 생산 스크리닝 기술을 활용하여 효모의 해당과정을 조절하였고, N-acetylglucosamine의 생산성을 증대시킨 결과를 얻음. 호기조건에서 바이오 부탄올 생산성을 높이기 위해, TCA 회로의 주요 효소인 citrate synthase의 발현을 조절하고자 했으며, 리보좀 결합 부위의 염기서열을 다변화하여 세포내의 acetyl-CoA pool을 확보하고 최적의 바이오부탄올 생산균주를 개발한 바 있음.

□ 연구결과의 활용계획
본 연구에서 확인한 CRISPR/Cas9을 이용한 효율적인 게놈편집 기술을 더 확장하여 호스트 균주에 외부 대사회로를 자유롭게 도입하여 artificial synthetic pathway를 구축할 수 있을 것으로 보임. 또한 세포 내의 발현량을 정교하게 조절하는 실험에도 CRISPR/Cas9 기술을 사용할 수 있을 것으로 보이며, 후속연구로 미생물의 전자전달계를 engineering 하는 실험을 계획 및 추진할 예정임. 미생물의 전자전달계는 막 단밸질로 구성이 되어있으며 막 단백질의 경우, 단순 낙아웃, 과발현이 아닌 정교한 발현량 조절이 이루어져야 미생물의 생장에 악영향을 미치지 않을 것으로 예상됨. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 미생물의 전자저달계를 조절하고 효율적인 바이오화합물 생산균주를 개발할 예정임.
(출처 : 한글요약문 4p)

Abstract ▼

□ Purpose & contents
The objective of this research project is to develop bio-energy producing microorganisms through high performance genome editing tools, CRISPR/Cas9. First of all, the protocol for operating CRISPR Cas9 in host microorganisms were established and genome editing was implemented

□ Purpose & contents
The objective of this research project is to develop bio-energy producing microorganisms through high performance genome editing tools, CRISPR/Cas9. First of all, the protocol for operating CRISPR Cas9 in host microorganisms were established and genome editing was implemented assisted with homologous recombination and non homologous end joining. The genome editing technology can show synergetic effect with screening methods for bio-chemicals producing strain. We applied this concept to develop tyrosine and bio-butanol producing strains.

□ Result
In this study, the plasmids for efficient operation of CRISPR/Cas system in host microorganisms were constructed. We developed crRNA, tracrRNA containg vector (pZS CRISPR) and Cas9 nuclease involving vector (pZA Cas9) systems and sacB from Bacillus subtilis was introduced for counter selection. These vector systems were directly applied to genome editing experiments such as point mutation, gene insertion and deletion. We also set up the protocol for dCas9 which can lower the expression level of certain genes. Thus we can achieved high N-acetylglucosamine producing S. cerevisiae by utilizing dCas9 and riboswitch based screening tools. We confirmed that dCas9 based strategy successfully reduced the expression level of glycolytic pathway genes which resulted in increase of N-acetylglucosamine productivity. Next, we tried to change the expression level of TCA cycle for bio-butanol production in aerobic condition. The ribosome binding sequence of citrate synthase (gltA) were manipulated in five levels. The yield and productivity of butanol were improved in mutant stains and optimal gltA expression level could be found out.

□ Expected Contribution
It is thought that various artificial synthetic pathway can be introduced by using genome editing technology constructed in this research project. Furthermore, fine tuning of targeted metabolism can be possible using CRISPR/Cas9 system. We has plan to develop electron transfer chain (ETC) engineered strains which is ciritical for controlling intracellular redox state. Most of the ETC proteins have functionality at inner membrane of bacteria. Therefore delicate control of expression level is essential not to deteriorate cell viability. Therefore, ETC engineered strains and high performance bio-chemicals producing strains can be constructed through CRISPR/Cas9 systems.
(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 9
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 16
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 18
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 27
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 28
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 28
• 8. 참고문헌 ... 29
• 9. 연구성과 ... 30
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 31
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 31
• 12. 기타사항 ... 31
• 별첨1 대 표 연 구 실 적 ... 32
• 별첨2 세부 목표 관련 증빙 ... 49
• 끝페이지 ... 54