초록 ▼

연구의 목적 및 내용
CO₂ 고정/전환 효소 공정 개발을 위한 해양열수구 유래 미생물로부터 고열안정성 Carbonic anhydrase를 발굴함. 해양열수구 유래 고안정성 신규 CA 다종 확보 및 대장균에서의 발현 시스템 구축 및 단백질 특성화. 이론적 설계(Rational Design) 및 분자진화 (Molecular Evolution)법을 활용한 고안정 CA의 고발현화 및 개량. 생물실리카화 기반의 CA 고효율 고정화기술 개발.

연구결과
해양열수구 미생물인 Persephonella marina EX-H1,

연구의 목적 및 내용
CO₂ 고정/전환 효소 공정 개발을 위한 해양열수구 유래 미생물로부터 고열안정성 Carbonic anhydrase를 발굴함. 해양열수구 유래 고안정성 신규 CA 다종 확보 및 대장균에서의 발현 시스템 구축 및 단백질 특성화. 이론적 설계(Rational Design) 및 분자진화 (Molecular Evolution)법을 활용한 고안정 CA의 고발현화 및 개량. 생물실리카화 기반의 CA 고효율 고정화기술 개발.

연구결과
해양열수구 미생물인 Persephonella marina EX-H1, Caminibacter mediatlanticus TB-2, Aliivibrio salmonicida, Thermovibrio ammonificans, Nitratiruptor sp SB155-2 총 5종을 선정하여 이들의 Carbonic anhydrase 유전자 서열을 확보함. 해당 단백질 서열 유전자를 최적화하여 대장균에서 과발현 시킴. 정제한 단백질을 이용하여 특성화 결과 PMCA, CMECA, TAMCA가 뛰어난 열안정성을 가지는 것을 확인함. 하지만 발현량이 낮아, FACS를 이용한 분자진화를 통해 CMECA의 발현량을 2배이상 증가시킴. 또한 이론적 설계를 통해 TAMCA의 발현량을 3배이상 증가시킴. 추가적으로 Disulfide bond 연구를 통해 CA활성을 2배 증가시키는 서열위치를 발굴함. 또한 분자동력학으로 고정화 위치를 파악하였고, 바이오실리카 기반의 고정화 기술을 개발함.

연구결과의 활용계획
확보한 고안정성 CA는 효소를 이용한 CO₂ 저감/전환 연구와 산업의 표준단백질로써 활용 가능함.
특히 고발현으로 개량된 CMECA와 TAMCA의 경우 CO₂ 저감/전환 산업에 활용될 수 있는 후보 단백질임.
누적된 정보와 기술은 단백질 개량의 밑바탕이 되는 자료로써 고부가가치 효소 개발에 활용 가능함.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose& contents
The purpose of this research is acquisition, directed evolution, immobilization of hyperthermostable carbonic anhydrase (CA) for enzymatic CO₂ sequestration process development.
1st year: Acquisition and expression of hyperthermostable CAs found in marine hydrothermal vent.

Purpose& contents
The purpose of this research is acquisition, directed evolution, immobilization of hyperthermostable carbonic anhydrase (CA) for enzymatic CO₂ sequestration process development.
1st year: Acquisition and expression of hyperthermostable CAs found in marine hydrothermal vent.
2nd year: Development of high-expressed CA variant with hyperthermostable trait using directed evolution.
3rd year: Development of efficient carbonic anhydrase immobilization system based on biosilification.

Result
We found 5 types of carbonic anhydrase gene derived from microbacteria named Persephonella marina EX-H1, Caminibacter mediatlanticus TB-2, Aliivibrio salmonicida, Thermovibrio ammonificans, and Nitratiruptor sp SB155-2 which live in deep marine vent. We optimized these genes to express in the E. coli system. We purified and characterized these proteins. We found PMCA, CMECA, and TAMCA exhibit high thermostability but poor expression. We enhanced the expression level of CMECA two-fold with directed evolution using FACS. And we succeeded increasing expression level of TAMCA three-fold with rational design. Additionally, we found a sequence location which make a disulfide bond to increase the activity of CA two-fold. Also, We found a sequence location for stable immobilization. Finally, We developed a new immobilization method using biosilica.

Expected Contribution
Constructed high thermostable CA could be a standard enzyme in field of CO₂ sequestration or conversion for researching.
Especially, mutant CMECA and TAMCA having high expression level could be a good candidate to use in industrial field.
Following information and technology in this research could contribute for engineering other proteins to enhance expression level and stability.

(출처 : SUMMARY 5p)