초록 ▼

본 과제는 고추열매탄저병 감염 시에 특이적으로 반응하는 유전자의 발현 및 작용기작의 특성을 비교 분석하여 저항성 기작을 일차적으로 이해하고 새로운 유전자원으로 활용하고자 하였다. 첫째, sequiterpene 에 속하는 항균물질 (capsidiol)의 생합성관련 유전자 그리고 곰팡이와 비친화적 반응에서 고추에서 특이적으로 발현되는 PepEST유전자를 분리하고 그 작용 기작을 분석하였다. 둘째, PepEST 유전자를 고추 식물체에 도입하여 transgene에 대한 세대간 안정적 발현을 확인하고 병저항성과 관련하여 transgene의

본 과제는 고추열매탄저병 감염 시에 특이적으로 반응하는 유전자의 발현 및 작용기작의 특성을 비교 분석하여 저항성 기작을 일차적으로 이해하고 새로운 유전자원으로 활용하고자 하였다. 첫째, sequiterpene 에 속하는 항균물질 (capsidiol)의 생합성관련 유전자 그리고 곰팡이와 비친화적 반응에서 고추에서 특이적으로 발현되는 PepEST유전자를 분리하고 그 작용 기작을 분석하였다. 둘째, PepEST 유전자를 고추 식물체에 도입하여 transgene에 대한 세대간 안정적 발현을 확인하고 병저항성과 관련하여 transgene의 발현 효과를 조사, 분석하였다. 그리고 셋째, 유전자 기능 분석에서 도출된 유용물질의 작용기작을 규명하여 항균효과를 검증하였다.

1) 고추의 병저항성 유전자 특성 및 기능 분석: 고추, 담배 등의 가지과 식물은 병원균에 감염되었을 때 다양한 식물병원균에 항균효과가 있는 sesquiterpene(capsidiol)을 합성한다. 본 연구에서는, capsisiol 생합성에 필요한 두 개의 생합성 효소 (sesquiterpene cyclase (STC)와 epi-aristolochene dihydroxylase (EAH))의 작용기작을 이해하기 위해서, 고추 genome에서 EA 생합성과 관련된 5개 STC 유전자 그리고 2개의 EAH 유전자를 분리하여 이들의 발현 양상을 조사하고, 재조합 단백질을 분리 정제하여 효소 활성을 조사하였다. 이들 유전자들이 chromosome상에 cluster를 이루면서 특정 유전자끼리 pair를 이루고 있는 것에 착안하여, pairing된 유전자의 산물이 기능적으로도 연결되어 서로 interaction하는 것을 확인하였다. 이 결과는 탄저병 곰팡이에 민감한 푸른고추에서 capsidiol 생합성이 억제되는 기작과 연관되어 있다. 그리고 carboxylesterase (CXE) family에 PepEST 유전자의 homolog를 분리하였다. 각각 감염된 열매와 정상적인 뿌리에서 발현되는 두 개의 PepEST 재조합 단백질은 유사한 효소 활성을 보이며, 병원균에 대해 항균효과를 나타낸다. 또한, PepEST1은 mehtyl salicylate esterase활성이 아주 약하게 있는 것으로 나타났다.

2) 고추 형질전환체 개발 및 분석: Agrobacteria를 이용하여 PepEST1유전자를 과발현시킨 고추 형질 전환체에서는 chromosome상의 T-DNA의 삽입 부위를 결정하였고, transgene이 후대에서도 안정적으로 유지되면서 발현되는 것을 확인 하였다. 형질전환 고추는 병에 감염되었을 때, PR 유전자들이 강하게 발현되었고, 특히 PepEST단백질과 같이 APX와 PR3 단백질이 상시적으로 고추 열매의 표피 조직에서 발현되며, 병원균 감염 시에는 이들 단백질의 축적이 증가하였다. 그리고 탄저병에 감염되었을때, 형질전환 고추의 병반 형성이 비형질전환체에 비해서 현저하게 억제되었다. 이는 곰팡이의 부착기형성이 저해된 결과로 나타났으며, C. gloeosporioides, C. acutatum, C. coccodes에서 유사한 결과를 보였다. 다만, 고추 역병균 (P. capsici)에는 PepEST 과발현이 효과가 없는 것으로 나타났다.

3) 주요 항균 물질의 분리 및 효능: 탄저병 곰팡이에 PepEST1 단백질을 처리하여 분리된 곰팡이 세포벽 물질을 Gas chromatograph를 사용하여 조사하였다. 그 결과, dithiandiol (DD)이 확인 되었고 곰팡이의 생장에 미치는 DD의 효과를 조사하였을 때, DD 농도에 비례하여 고추열매탄저병 포자의 생장 및 분화가 억제되었다. 또한 DD가 곰팡이 포자의 viability에 영향을 미치는지 관찰하고자 flow cytometer로 조사한 결과, DD 농도가 높아지면 곰팡이 세포의 necrosis가 증가하는 것으로 나타났다. 이에 따라, DD를 전처리한 고추에 고추열매탄저병 포자를 접종하면 병반 형성이 감소되는 것을 볼 수 있었으며, 약 1mg/mL의 DD를 처리하면 고추 탄저병이 완전히 제어되었다. 이런 효과는 벼(Magnaporthe grisea), 토마토 (Phytophthora infestans), 밀 (Puccinia recondite), 고추(Colletotrichum gloeosporioides) 등의 병원균에서도 확인되었다. 그리고 PepEST1 단백질을 고추열매의 표면에 처리하여 octadecenamide를 분리하였다. 이에 octadecenamide를 병원균 포자에 처리했을 때, 포자 발아가 억제되면서 식물 세포를 보호하는 효과가 있는 것으로 확인되었다

(출처 : 연구결과 요약문 3p)

Abstract ▼

Our research goals were characterization of a novel resistant genes that are implicated in phyto-pathogen interaction and the biotechnological application of the gene into pepper plant to control phyto-pathogens. To improve the resistance of the pepper plants against anthracnose disease, pepper tran

Our research goals were characterization of a novel resistant genes that are implicated in phyto-pathogen interaction and the biotechnological application of the gene into pepper plant to control phyto-pathogens. To improve the resistance of the pepper plants against anthracnose disease, pepper transgenic plants was generated. On the other hand, two antifungal agents were developed using fungal- and pepper-derived compounds, and evaluated for their antifungal activities against the anthracnose fungus and so on.

1) Characterization and analysis of defense related genes in pepper:
Since sesquiterpene (capsidiol) has antifungal effect to a variety of plant pathogenic fungi, biosynthetic enzymes (sesquiterpene cyclase (STC) and epi - aristolochene hydroxylase (EAH) were isolated and characterized. These genes are clustered in pepper genome and two sets of genes were paired together. Thus, gene expression and enzyme kinetics were analyzed for 5 STCs and 2 EAHs in pepper. Our result show that the products of paired genes has binding affinity and co-localized in intracellular space. And two carboxylesterases (CXE), such as PepEST1 and PepEST2, were characterized. While PepEST2 is constitutively expressed in the roots, PepEST1 was induced by fungal infection. But their recombinant proteins showed similar enzyme activities. Also, PepEST1 revealed weak methyl salicylate esterase activity.

2) Analysis of transgenic pepper plants:
T-DNA insertion site was determined in the chromosomes of transgenic peppers that were transformed by Agrobacterium mediated method. The transgenes were stably maintained and expressed in those transgenic progenies. The transgenic pepper fruits expressed PR genes after fungal infection. Particularly, APX and PR3 proteins, as well as PepEST, were weakly expressed constitutively in the epidermis of healthy fruits and then their expression was enhanced after infection. Finally, disease rate was significantly decreased in the transgenic fruits compare to the non-transgenic fruits. Similar results were shown against C. gloeosporioides, C. acutatum, and C. coccodes. However, the overexpression of PepEST was turned out to be ineffective against P. capsici.

3) Isolation and efficacy of antifungal compounds:
When recombinant PepEST1 was treated to anthracnose fungus, a new antifungal compound was identified by GC-MS. The fungal cell wall substances showed antifungal activity to major phto-pathogens. The antimicrobial effect was tested in rice (Magnaporthe grisea), tomato (Phytophthora infestans), peppers (Colletotrichum gloeosporioides), wheat (Puccinia recondite). Second antifungal compound that was isolated in the surface of pepper fruits revealed some protection of pepper cells against anthracnose fungus.

(출처 : SUMMARY 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• 국문요약문 ... 3
• Summary ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 6
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 12
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 12
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 13
• Ⅲ. 연구성과 ... 14
• 끝페이지 ... 15