초록 ▼

본 연구는 식물의 생장 및 발달 전반을 조절하는 핵심 식물 호르몬 옥신에 의한 구체적인 식물 세포신장 과정을 최종적으로 규명하고자 하는 대명제의 해결을 위해, 옥신에 의한 세포신장 조절경로의 주요 구성요소인 SAUR 유전자 집단 및 SAUR 단백질들의 식물체내 기능을 규명하고, 프로테아좀에 의한 SAUR단백질의 분자 수준의 조절 메커니즘을 규명하는 것을 최종 목표로 설정하여 진행되었다. 우선 애기장대의 SAUR 유전자 집단에서 분석 대상 유전자들을 선별하기 위하여 in silico transcriptome analysis를 수행하였

본 연구는 식물의 생장 및 발달 전반을 조절하는 핵심 식물 호르몬 옥신에 의한 구체적인 식물 세포신장 과정을 최종적으로 규명하고자 하는 대명제의 해결을 위해, 옥신에 의한 세포신장 조절경로의 주요 구성요소인 SAUR 유전자 집단 및 SAUR 단백질들의 식물체내 기능을 규명하고, 프로테아좀에 의한 SAUR단백질의 분자 수준의 조절 메커니즘을 규명하는 것을 최종 목표로 설정하여 진행되었다. 우선 애기장대의 SAUR 유전자 집단에서 분석 대상 유전자들을 선별하기 위하여 in silico transcriptome analysis를 수행하였다. 공개/비공개 Microarray database와 RNA-seq database를 이용하여 옥신 및 세포신장 관련 SAUR 유전자들을 스크리닝한 결과 12개의 SAUR 유전자들을 분석대상으로 최종 선별하여 이들을 대상으로 기능성 규명 연구를 수행하였다. 선별된 SAUR 유전자들의 기능규명을 위한 핵심 연구로서 loss-of-function기법을 이용하여 SAUR 기능 억제/상실 돌연변이체를 제작하고 분석을 수행하였다. 우선 제작된 2개의 SAUR 유전자에 대한 artificial microRNA 기능억제 형질전환체에 대해서는 표현형 분석시 야생형과의 유의미한 차이를 확인할 수 없었으나, 새롭게 추가로 도입한 CRISPR/Cas9 기법을 이용하여 제작된 7개의 SAUR 유전자들의 단일 또는 복합 기능상실 돌연변이체들의 경우 homozygous lines에 대한 표현형에 대한 분석작업을 수행한 결과 최소 4개의 유사 SAUR 유전자들의 단일 또는 복합 돌연변이체에서 유식물 하배축 신장의 억제, 굴성 반응 억제, 암배양시 정단훅 형성 지연 등 옥신에 의해 조절되는 세포 신장 반응의 이상 현상을 확인할 수 있었다. 또한, 분석대상 SAUR 유전자들의 loss-of-function 분석과 더불어 35S CaMV promoter를 이용하여 과다발현시킨 gain-of-function 형질전환체를 제작함으로써 그 기능성을 확증하고자 하는 연구를 진행하였다. 그 결과 총 8개의 SAUR 유전자들의 과다발현 형질전환체의 T3 homozygous line들을 모두 확보하였다. SAUR 유전자들을 GFP와 융합시켜 과다발현시킨 형질전환체 (p35S:GFP-SAUR)의 경우 표현형상으로 매우 뚜렷한 옥신 및 세포신장 연관 표현형이 나타났다. 분석을 수행한 8개의 기능획득 형질전환체는 모두 유식물의 하배축 생장 촉진, 뿌리의 과도한 굴곡생장이 관찰되었다. 또한 2개의 유사 SAUR 유전자들의 과다발현 형질전환체는 암배양시 정단 훅 열림현상이 빠르게 촉진되는 현상과 하배축에서 안토시아닌 축적 현상을 관찰할 수 있었다. SAUR 유전자들의 공간적 발현양상 분석을 위해 promoter-GUS/GFP constructs를 제작하고 공간적 발현양상 분석을 통해 이들 SAUR 유전자들의 옥신 및 세포신장과의 연관성을 분석하였다. 총 6개의 SAUR promoter-GUS constructs와 4개의 SAUR promoter-GFP constructs 제작이 완료되었고, 형질전환체의 유식물에 대한 조직별 발달단계별 분석을 진행하였다. GUS 발현양상 분석 결과 개별 SAUR 유전자별로 특이적인 발현양상을 확인할 수 있었는데, 특히 하배축 발달 과정에서 3개의 SAUR 유전자들의 발현이 점차 증가되는 양상을 확인할 수 있었다. 또한 뿌리에서 특이적으로 발현이 증가하는 SAUR와, 굴성 처리 조건에서 발현양상의 변화가 관찰되는 SAUR를 각각 최소 1개씩 확인할 수 있었다. 선행연구를 통해 확보된 SAUR 상호작용 F-box 단백질을 SF로 명명하였고, SF 단백질이 ubiquitination/26S proteasome 경로를 통해 SAUR 단백질의 안정성을 조절할 가능성을 확인하기 위하여 SF 단백질 암호화 유전자의 T-DNA 삽인기능상실 돌연변이체와 SF 과다발현 형질전황체의 T3 homozygous line들을 최종 확보한 후 표현형을 관찰하였다. 그 결과 기능상실 돌연변이체(sf-1)와 p35S:HA-SF, p35S:SF-GFP의 과다발현 형질전환체 또한 야생형과의 차이점을 관찰할 수 없었다. 하지만, p35S:SF의 경우 떡잎 생장 억제, 하배축생장 억제,잎자루 생장 억제 등 전반적인 유식물 발달과정에서의 결함이 관찰되었으며, 일반적인 생육조건이 아닌 고온조건, 암조건, 적색광 생육 조건 등에서도 이러한 결함이 뚜렷하게 관찰되었다. 이러한 결과는 SF가세포 신장을 억제하는 식물체내 기능적 역할을 수행함을 제시하고 있으며, 이는 SAUR의 기능이 세포 신장 촉진과 관련되어있음을 고려할 때 SF가 SAUR 기능을 억제함으로써 조절 작용을 수행할 가능성을 강력하게 시사하는 결과이다. 따라서, 이를 검증하기 위하여 SF 과다발현 형질전환체와 SAUR 과다발현 형질전환체를 교배하여 상위성 검증을 하였고, 이 교배체의 경우 SAUR 과다발현에 의한 표현형이 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한, SF와 SAUR 사이의 단백질 상호작용을 통한 억제과정을 확인하기 위한 또다른 방법으로서 p35S:SF x p35S:GFP-SAUR19 교배체 제작을 진행하였고, p35S:SF 형질전환체로부터 단백질을 추출한 후 SF 단백질의 과다발현을 확인하는 실험을 진행하였다. RT-PCR 실험을 통해 SF 유전자의 과발현을 확인할 수 있었고, GFP-SAUR의 발현이 억제되는 현상을 형광분석 과정을 통해 1차적으로 확인하였다. 상기 결과를 종합할 때 개별 SAUR 유전자들의 “산-생장 가설” 관련 조직별, 발달단계별 차별적인 세포신장 반응 연관성을 규명해낼 수 있었으며, 단백질 분해에 의한 SAUR의 안정성 조절 메커니즘도 확인함으로써 설정된 연구 목표를 달성하였다.

( 출처 : Ⅰ. 연구결과 요약문 3p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 6
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 6
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 6
• Ⅲ. 연구성과 ... 7
• 끝페이지 ... 8