초록 ▼

Aspergillus nidulans에서 MpkB MAPK에 의한 신호전달이 유성분화, 무성분화 그리고 이차대사 산물인 sterigmatocystin (ST) 진균독소 분비 조절에 대한 기능을 알아보기 위하여 기존에 확보하고 있는 mpkB 유전자 제거 돌연변이 균주 및 mpkB MAPKK 단백질의 인산화 도메인 부위를 point mutation 시켜 MpkB 단백질이 constitutive activating/constitutive inactivating 활성을 가지도록 하는 돌연변이들을 제조하여 그 형질을 분석하였다 (1차년도

Aspergillus nidulans에서 MpkB MAPK에 의한 신호전달이 유성분화, 무성분화 그리고 이차대사 산물인 sterigmatocystin (ST) 진균독소 분비 조절에 대한 기능을 알아보기 위하여 기존에 확보하고 있는 mpkB 유전자 제거 돌연변이 균주 및 mpkB MAPKK 단백질의 인산화 도메인 부위를 point mutation 시켜 MpkB 단백질이 constitutive activating/constitutive inactivating 활성을 가지도록 하는 돌연변이들을 제조하여 그 형질을 분석하였다 (1차년도 연구결과). 이를 위해 본 연구팀은 constitutive activating 균주와 constitutive inactivating 균주 제조를 위한 plasmid를 구축하였고 제작된 발현 vector는 A. nidulans mkkB 삭제 돌연변이 및 야생형 균주에 형질전환을 실시하였다. 확보된 형질전환체들은 diagnostic PCR 및 southern blot 혼성화 방법으로 constitutive activating 및 constitutive inactivating 균주를 screening하였다. 유전학적으로 검증된 constitutive activating 및 constitutive inactivating 균주들의 형질을 조사한 결과 유, 무성분화의 패턴, 생성된 포자의 수, 분화기관의 형태학적 이상 유무 및 ST 생합성 결과를 야생형 균주와 MpkB MAPK 삭제 돌연변이 등과 함께 분석한 결과 MpkB MAPK는 A. nidulans의 유성분화 뿐만 아니라 무성분화과정에서도 생식기관의 형태적 분화를 조절하고 무성포자의 생산에도 영향을 준다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 MpkB MAPK 신호가 ST 생합성과 관련이 있다는 기존의 연구결과와는 달리 MpkB MAPK는 ST의 생합성과는 관련이 없음을 새롭게 확인하였다. 이러한 연구결과를 근거로 본 연구팀은 확보한 돌연변이 균주들과 야생형 균주에서 MpkB MAPK 신호전달의 차이를 규명하기 위하여 각각의 균주에서 특정 분화시기에 맞춰 발현되는 전체단백질를 분리한 후 이를 대상으로 2D-gel 전기영동 분석을 실시하였다 (2차년도 연구결과). 야생형과 constitutive activating 및 constitutive inactivating 균주에서 단백질 발현의 변화가 뚜렷한 총 379개의 spot들을 확보하고 이중 단백질 동정이 가능한 39개의 spot을 선별하여 MS/MS를 이용한 peptide mass fingerprinting (PMF) 방법으로 분석함으로써 MpkB MAPK의 표적 후보군을 조사하였다. 또한 보다 직접적인 MAPK 단백질의 표적 유전자를 확보하기 위하여 단백질의 인산화가 균주 특이적으로 일어나거나 일어나지 않는 총 100개의 spot들을 인산화단백질체 분석을 통하여 확보하고 이중에서 MpkB에 의해 단백질의 인산화가 상승 조절되는 spot 15개를 선정하여 PMF 방법으로 단백질 동정하였다. A. nidulans의 MpkB MAPK와 관련된 단백질체의 최종 분석결과 oxidative stress에 관련된 단백질들이 많이 포함되어 있는 것으로 확인되었다. 미토콘드리아와 관련된 단백질도 일부 확인하였으며, 이러한 단백질들도 역시 oxidative stress와 관련이 있을 것으로 추측되었다. 이러한 결과들을 종합 할 때, A. nidulans의 분화와 oxidative stress와 관련이 있을 가능성이 있으며, 이 과정에서 MpkB의 역할이 필요할 것으로 예상되었다. 2D-gel 분석으로 확인된 유전자 군들 중 in silico 분석을 바탕으로 전사인자 (transcription factor)이거나 혹은 MpkB MAPK 신호경로의 regulator 또는 activator로서 작용 할 것으로 고려되는 유전자들을 선별하고, 이를 대상으로 유전자 제거 돌연변이 균주들을 제작하여 총 8개의 유전자 제거 돌연변이 균주를 확보하였다 (3차년도 연구결과). 이 돌연변이 균주들에 대한 형질분석을 실시하여 MpkB MAPK 신호경로와의 관련 여부를 조사하고 있으며, 동시에 Aspergillus flavus 균주에서도 MpkB MAPK constitutive activating 균주를 제작하여 그 형질이 A. nidulans 균주들과 유사한지 혹은 차이가 나는지를 확인하였다. A. flavus MpkB MAPK constitutive activating 균주는 생장의 패턴, 생성된 포자의 수, 분화기관의 형태학적 이상 유무 및 진균독소의 생합성 조사결과 등 A. nidulans 균주와 비교했을 때 상당히 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

(출처 : 연구결과 요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 7
• Ⅲ. 연구성과 ... 8
• 끝페이지 ... 10