초록 ▼

연구의 목적 및 내용
일산화질소 (nitric oxide, NO)가 세포주기 (cell cyle)에 관련 있다는 보고는 있지만 분자수준에서의 기전은 발표된 바 없음. 혈관내피세포에서 세포주기 단백질인 cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)가 니트로화 (nitrosylation)되는 것을 확인함. 본 연구는 CDK6의 nitrosylation이 (CDK6의 결합단백질인) cyclin D와 CDK6의 결합을 저해함으로써 CDK6의 활성을 억제하여 세포주기에 영향을 줄 것이라는 가설을 세우고 증명하고자 함.

연구의 목적 및 내용
일산화질소 (nitric oxide, NO)가 세포주기 (cell cyle)에 관련 있다는 보고는 있지만 분자수준에서의 기전은 발표된 바 없음. 혈관내피세포에서 세포주기 단백질인 cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)가 니트로화 (nitrosylation)되는 것을 확인함. 본 연구는 CDK6의 nitrosylation이 (CDK6의 결합단백질인) cyclin D와 CDK6의 결합을 저해함으로써 CDK6의 활성을 억제하여 세포주기에 영향을 줄 것이라는 가설을 세우고 증명하고자 함.

연구결과
● GSNO　（nitric oxide donor)를 EC (endothelial cell)에 처리한 후 CDK6에 대한 nitrosylation assay를 수행하였고, EC에 eNOS 억제제 (L-NAME)를 처리하면 CDK6의 nitrosylation이 일어나지 않음을 확인하였으며, 이런 결과는 EC에서의 CDK6 nitrosylation은 eNOS에 의한 것임을 알 수 있었음.

● Nitrosylation site인 cysteine 잔기를 serine으로 치환시켜 C15S, C83S, C207S, C280S 를 발현하는 각각의 CDK6-CS (nitrosylation site가 cysteine (C)에서 serine (S)을 mutation 됨)를 제작함.

● 각각의 CDK6-CS를 HEK29T 세포에 transfection 한 후 nitrosylation assay를 수행하여 CDK6의 여러 cysteine 중 207과 280번째 cysteine에서 nitrosylation이 일어남을 알 수 있었음.

● WT-CDK6-GFP 혹은 CDK6-C207S/C280S를 EC에 transfection 시킨 후 IFA를 수행하여 세포내 위치 변화를 분석하였음. WT-CDK6는 세포질과 핵에 존재하는 반면 nitrosylation이 안되는 CDK6-C207S/C280S는 CDK6는 세포질에 위치하고 있음을 알 수 있었음.

● EC에 GSNO을 0, 100, 200, 400 μM로 2시간 동안 처리한 후 co-immunoprecipitation assay를 수행하여 CDK6와 cyclin D1의 결합 변화를 분석하였음. GSNO의 농도에 따라 CDK6와 cyclin D1의 결합이 증가됨을 확인함.

● WT-CDK6-GFP 혹은 CDK6-C207S/C280S를 EC에 transfection 시키고 wound healing assay를 starvation 14시간 후에 수행하였음. WT-CDK6를 과발현 시킨 EC의 세포이동은 증가되었지만 CDK6-207S/280S는 세포이동에 변화가 없었음. eNOS에 의해 생성되는 NO가 CDK6를 니트로화 시켜 세포핵으로 이동하여 EC의 migration을 유도함을 추정할 수 있었음.

연구결과의 활용계획
지금까지 NO연구는 대부분 혈관확장 (vasodilation) 효과와 관련되어 보고되어졌으나, CDK6 nitrosylation을 통해 내피세포의 새로운 신호전달물질을 동정할 수 있음. 또한 EC의 세포주기와 관련된 vasculogenesis 및 angiogenesis에 의해 유발되는 암, 당뇨병성망막증 등의 예방/치료에 기초기반 지식을 제공할 수 있음.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose&contents
Nitric oxide (NO) has been involved in the cell cycle, but no mechanism at the molecular level has been reported. We confirmed that cyclin-dependent kinase 6 (CDK6), a cell cycle protein, is nitrosylated in vascular endothelial cells. This study demonstrates that nitrosylation of

Purpose&contents
Nitric oxide (NO) has been involved in the cell cycle, but no mechanism at the molecular level has been reported. We confirmed that cyclin-dependent kinase 6 (CDK6), a cell cycle protein, is nitrosylated in vascular endothelial cells. This study demonstrates that nitrosylation of CDK6 inhibits the binding of cyclin D and CDK6 (binding proteins of CDK6), thereby inhibiting the activity of CDK6.

Result
● Nitrosylation assay for CDK6 was performed after treating GSNO (nitric oxide donor), and nitrosylation of CDK6 did not occur when EC was treated with eNOS inhibitor (L-NAME).

● Substituting the serine for the cysteine residue, which is a nitrosylation site, produced CDK6-CS (mutation of serine (S) in cysteine (C)) at each of the CDK6-CSs expressing C15S, C83S, C207S and C280S.

● After transfection of each CDK6-CS into HEK29T cells, nitrosylation assay was performed to find that nitrosylation occurred at 207 and 280th cysteine among CDK6 cysteines.

● After transfection of WT-CDK6-GFP or CDK6-C207S/C280S into EC, IFA was performed to analyze changes in intracellular location. WT-CDK6 is present in the cytoplasm and nuclei, while CDK6-C207S / C280S, which is not nitrosylated, is located in the cytoplasm.

● EC was treated with GSNO at 0, 100, 200, and 400 μM for 2 hours, and co-immunoprecipitation assay was performed to analyze the binding changes of CDK6 and cyclin D1. It was confirmed that the binding of CDK6 and cyclin D1 increases with the concentration of GSNO.

● WT-CDK6-GFP or CDK6-C207S/C280S were transfected into EC and wound healing assay was performed after starvation. Cell migration of ECs overexpressing WT-CDK6 was increased, but CDK6-207S/280S did not change cell migration. It could be assumed that NO generated by eNOS nitrosylates CDK6 and translocate to the nucleus to induce migration of EC.

Expected Contribution
Until now, NO studies have been mostly limited to the vasodilation effect, but CDK6 nitrosylation can be used to identify new signaling molecules in endothelial cells. It can also provide a basis for prevention / treatment of cancer, diabetic retinopathy, etc. caused by vasculogenesis and angiogenesis associated with the nitrosylation.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 6
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 6
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 14
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 15
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 15
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 15
• 8. 참고문헌 ... 15
• 9. 연구성과 ... 18
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 20
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 20
• 12. 기타사항 ... 20
• 별첨1. 대 표 연 구 성 과 ... 21
• 끝페이지 ... 23